Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
спирали. Следовательно, чтобы рассчитать
* Список обозначений см. на стр. 57.
56
Глава 4
изотерму связывания, следует принять во внимание энтропию образования
петли свитой вдвое полиуридиловой кислоты. Используя нолилогарифмическую
функцию Lia(x) из
с= [~/sN pN~] (р - bA)\~lt (4.15)
получаем
с = с4-с__________=______-______Р~ЬА --------------------- щ jg.
^ " p'+M2)/p/(l-/p) + 2]g(l-)/p)-p|+(.V-lMp-M)'v
где
А =4 lg (1 - ]/p)-f 4L(2 (/р) + р.
Когда р - параметр, можно получить изотерму связывания. Если принять во
внимание влияние исключающего объема, то параметр а можно принять равным
2. Он входит во множитель функции разделения, возникающий благодаря
образованию петель спирали:
2"-6 0'+!)/(/+ 2)".
Полагая известным кооперативный параметр Ь (0,1-0,001), можно
смоделировать изотерму связывания и кривые элюирования; при этом
полученные кривые элюирования будут иметь прямоугольный вид, поскольку
при некоторой концентрации олиго-Mepa'tfsoTepMa связывания резко
стремится к нулю, что отражает влияние энтропии образования петли из двух
цепей полимера. Однако экспериментальные кривые элюирования не являются
прямоугольными (рис. 3.10) и экспериментальная изотерма связывания не
стремится резко к нулю (рис. 3.8).
Расхождение теоретической модели и экспериментальных данных можно
объяснить следующим образом. Поскольку отношение c-ujc равно 102-103 и
число дифосфатных групп в полиуридиловой кислоте составляет Ю2-103 на
макромолекулу, образованием петли полиуридиловой кислоты с
олигоадениловой кислотой при их свивании можно пренебречь (для бесконечно
длинных полимеров такое приближение неправильно). Следовательно, в
двойной или тройной спиралях можно не принимать во внимание петли. В
данных экспериментальных условиях полиуридиловая кислота, по крайней мере
частично, образует двойную спираль. Следовательно, предложенное выше
решение, подтвержденное в случае образования двойной спирали, верно также
и в случае образования тройной спирали при кооперативной адсорбции на
линейной цепи.
Химическое освобождение связанного олигомера протекает за ~10 мс, это
достаточно быстро по сравнению с временем диффузии внутрь геля при
скорости потока 5-40 мл/ч. Поэтому предположение, что устанавливается
химическое равновесие, справедливо. Хотя нельзя считать, что при
элюировании скорость потока
Применение аффинной хроматографии для оценки комплексообразования 57
(20 мл/ч) достаточно мала по сравнению со скоростью диффузии, кривые
элюирования сохраняют свой вид даже при восьмикрат-. ним изменении
скорости потока. Следовательно, число•тарелок, по-видимому, достаточно
велико и данное аналитическое решение верно.
Используя уравнение (3.46) (разд. 3.2), можно определить
термодинамические параметры, исходя из траектории экспериментального
пика. Пересечение траектории с осью VC дает функцию разделения для
изолируемого связанного олигомера:
Vei°lrVt (4.17)
а наклон в этой точке дает функцию разделения-
4~ ( = 2 (2-5а) а (y/)a цси. (4.18)
vt \ йс /с= о
По этому методу при ? = 0,55 и с" =0,98-10_3 моль/л для 1 М раствора
хлорида натрия при 10°С найдено Xs2 - 3,4-104 л/моль (±50%), а при 5°С
xs2 = 8'104 л/моль (±50%). К сожалению, с, от которой зависит
удовлетворительное соотношение сигнал - шум для кривой элюирования,
недостаточно мала, чтобы можно было ограничиться двухчленным
приближением. В результате траектория пика - вогнутая и оба значения
нельзя определить с достаточной точностью, однако они очень приближенно
соответствуют величинам, получаемым из изотермы связывания.
Список используемых обозначений
N - степень полимеризации олигоадениловой кислоты
Си, си -концентрация всех и свободных участков связывания в цепи
полиуридиловой кислоты соот-_ ветственно с, с - концентрация всей и
свободной олигоаденило-_ вон кислоты соответственно
0ц = (си-си)/си - содержание спиральной формы в полиуридиловой кислоте
f(c)=(c" - си)/си - коэффициент адсорбции олигомера на полимере как
функция общей концентрации олигомера s -функция разделения нуклеотидной
пары в связанном состоянии, если функция разделения в свободном состоянии
принимается равной единице
st - функция разделения связанного олигомера, имеющего соседний связанный
олигомер и комплементарный ему участок
58
Глава 4
X=5i(sa,c) - поправочный коэффициент для концевого эф фекта олигомера а -
параметр мсжолигомерной кооперативное^ (равный отношению функции
разделения изо лируемого связанного олигомера и его компле мента к Si)
4.4. ДРУГИЕ МЕТОДЫ КОЛИЧЕСТВЕННОЙ ОЦЕНКИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С
ИММОБИЛИЗОВАННЫМИ АФФИННЫМИ ЛИГАНДАМИ
Возможность получения количественных данных по < нию для взаимодействия
белков с иммобилизованным г впервые исследована Гавронским и Уолдом [8].
Определ станта диссоциации, равная (2,5± 1,0) ¦ 10-6 моль/л, путем iv..
титрования S-белка рибонуклеазы, связанного с S-пептидом, мобилизованным
на агарозе. Хорошие кривые титрования im..; чены при концентрации S-белка
