Аффинная хроматография - Туркова Я.
Скачать (прямая ссылка):
своем движении по колонке от бычьего сывороточного альбумина. При
концентрации лиганда [5'-АМР] =0,125 мкмоль/мл, когда лактатдегидрогеназа
количественно элюировалась при наложении градиента концентрации соли, 1 г
сорбента связывал 0,1 нмоль фермента. Таким образом, для связывания
лактатде-
0,4
0Л
о
0,4
02 о А
Я о Т 0,4
02
0
0,4
ог
о
Рис. 5.6. Влияние концентрации лиганда на элюирование глюкокиназы
глюкозой с 2 амино-2-дезокси-о-глюкопиранозо-Ы- (6-аминогексаноил)-
сефарозы [15].
Колонки (100X8 мм) предварительно уравновешивались 20 мМ буфером
(триэтаколамнн f +НС1. pH 7.0). содержащим 10 ммоль/л KCI-t-4 моль/л
ЭДТА+7.5 мксль/л MgCI?+i ммоль,.1! дитиотреитол+5 об, % глицерина:
скорость потока 20 мл/ч, объем фракции 3 мл. После на несения глюкокичаэы
(2 мл, 2Е'мл}. очищенной хроматографией на ДЭАЭ-цсллюлпзе, ко лонка
промывалась 25 мл уравновешивающего буферного раствора. Л - начало
элюнрованн? линейным градиентом, образуемым 75 мл уравновешивающего
буферного раствора н 75 м; I М глюкозы, приготовленной на этом же буфере.
В - в элюирующий буферный раствор до бавлялся KCJ до концентрации 0,5
моль/л. Содержание присоединенного производного глю Козамина (в мкмолях)
в 1 г геля: а - 1,2; б - 3,75; в- 6,0; г-10. Сорбент с заданной кон
центрацией лиганда готовился разбавлением геля с концентрацией лиганда 10
мкмолъ/r незамещенной сефарозой. / - Д^во'. 2 - активность глюкокиназы.
Пунктиром показано измене
ние концентрации глюкозы.
гидрогеназы используется только 0,1 % прикрепленного аффинногг лиганда.
Близкое значение получено также при фронтальном хро матографическом
анализе. При более низких концентрациях лиганда оно снижается до 0,025%.
Как видно на рис. 5.7, а, кривая зависимости емкости Ы6-(6-аминогексил)-
5'-АМР - сефарозы ш лактатдегидрогеназе от концентрации лиганда
(равномерно рас пределенного в гранулах сорбента) имеет вид сигмоиды [6].
Ш основании этого можно сделать вывод, что для задержки лактат
дегидрогеназы на колонке необходимо, чтобы рядом раслолага лось более
одной молекулы иммобилизованного лиганда [8]. Сиг-
го 40 60
Номер франции
0,8
0.4
¦0
-0,8
0,4
0
-0,8
-0,4
I
§
ЙГ
I
5
0,0 | 0,4
Общие вопросы связывания на аффинном сорбенте
моидный вид кривой может говорить о кооперативном взаимодействии фермента
с иммобилизованным лигандом. Это подтверждает идею, что.более высокие
концентрации лиганда ограничивают диссоциацию фермента с матрицы и
удерживают его в комплексе с лигандом в больших количествах, чем это
следует из обратимого равновесия. Такое кооперативное связывание
отражается сигмоидной формой кривой зависимости количества связанного
фермента от концентрации лиганда и наблюдается
Рис. 5.7, Влияние распределения аффинного лиганда на емкость Xе-(6
амнногек-сил)-5'-АМР-сефарозы по лактатдегидрогеназе [6J.
а - лиганд равномерно присоединен к сефарозег б -лиганд разбавлен
иемоднфицнровэнной
сефароэой.
только при равномерном распределении молекул лиганда в геле (рис. 5.7,а).
В том случае, когда лиганд неравномерно распределен и изменение его
концентрации в геле достигалось путем разбавления геля немодифицироваиной
сефарозой, такая зависимость выражалась обычной гиперболической кривой
насыщения (рис. 5.7, б).
Подобным образом Нишикава и др. [24] сопоставили гели,
содержащие различные концентрации аффинанта, с учетом распределения
лиганда в геле и рассмотрели как емкости по ферменту на единицу геля, так
и аффинности гелей к ферменту. Концентрация лигандов в геле влияет на оба
эти свойства, но не в одинаковой степени. Гранулы геля с высокой
концентрацией аффинанта обладают высоким сродством и соответственно
высокой емкостью в колонке. Если гель разбавить немодифицироваиной
агарозой, концентрация лиганда внутри геля в модифицированных
78
Глава 5
Таблица 5.2
Взаимодействие миокиназы с Р1-(в-аминогексил)-Р2-(5'-аденозин)пирофосфат-
сефарозой3
Концентрация лиганда 5Г-АМР, мкмоль/мл (((концентрация KCI, ммоль/л)(r)
Количество связанного фермента (% к 5'-АМР)
% к 5'-АМР Е на 1 г сорбента Е на 1 мкмоль S'-AMP
6.00 400 100 4,00 0,67
3,0 315 100 4,00 1,33
1.00 200 97,4 3,90 3,90
0,50 185 90,4 3,62 7,24
0,30 140 83,3 3,33 11,10
0,10 95 42,5 1,69 16,80
0,05 70 27,0 1,08 21,55
0,03 50 14,7 0,59 19,60
Образец фермента (100 мкл), содержащий миокиназу (4 Е) и бычий
сывороточный альбумин (1,5 МП, наносили на колонку (50X5 мм), содержащую
I г РМб-аминотексилЬР1-(5'*&Д?ном1и)лнрофосфат - гефароэу; сорбент
разбавлялся до требуемой концентрации лиганда немодифицироваиной
сефарозой 4В.
гранулах останется высокой и гель сохранит свою высокую аффинность.
Однако теперь уже не все гранулы геля способны связывать фермент, и,
следовательно, колоночная емкость понизится. Наконец, если гель
равномерно модифицирован лигандом, но концентрация последнего низкая,
низкими будут и аффинность, и колоночная емкость.
Изменения аффинности и емкости Р1-(6-аминогекеил)-Р2-(5/-аденозин)
