Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Как и в случае окрашенных адсорбентов (см. разд. 4.6), здесь также можно практически неограниченно варьировать природу заместителей, однако все эти адсорбенты ведут себя сходным образом. Чтобы сделать правильный выбор адсорбента, достаточно проверить образцы фенил-, октил-, гексил- и аминогексил-агароз, которые удовлетворяют всем потенциально возможным требованиям.
Функционирование гидрофобных адсорбентов основано на взаимодействиях, не играющих существенной роли в функционировании других адсорбентов. Поэтому теоретически следует ожидать, что с их помощью можно разделить компоненты смеси, которые ведут себя одинаково, например при ионообменной хроматографии. На практике же использование гидрофобной хроматографии ограниченно, поскольку этим методом не удается достичь четкого разделения фракционируемой смеси. Это обусловлено тем, что при изменении условий величина а изменяется медленно, и это приводит к значительному перекрыванию пиков отдельных компонентов (рис. 4.52). Кроме того, поскольку принципы гидрофобной хроматографии очень сходны с принципами дробного высаливания, в тех случаях, когда последний метод уже использовался, остается очень мало шансов получить хорошее разделение на гидрофобной колонке. Эти пессимистические соображения уравновешиваются некоторыми положительными моментами. Во-первых, емкость гидрофобных ионообменников по отношению к белкам весьма высока и находится в тех же пределах, что и у ионообменников, а именно 10— 100 мг/см3. Во-вторых, поскольку адсорбция проводится при вы-
Разделение белков путем адсорбции
181
соких концентрациях соли, нет необходимости в смене буфера перед нанесением образца; нужно лишь добавить достаточное количество соли, чтобы обеспечить связывание интересующего нас компонента смеси. Вследствие стабилизирующего эффекта солей белок элюируется из колонки с очень хорошим выходом. Стабилизация плотности элюента позволяет точно поддерживать понижающийся градиент концентрации соли, что обеспечивает оптимальное поведение колонки.
Белки, прочно адсорбирующиеся даже при низких концентрациях солей, обычно плохо растворимы в воде; к ним относятся глобулины, мембраносвязанные и другие белки, осаждающиеся при низких степенях насыщения сульфатом аммония (20—40%). Все они с трудом удаляются с колонки. Гидрофобные взаимодействия можно ослабить: а) снижая температуру, б) добавляя органические растворители, в) включая в среду полиолы, особенно этиленгликоль, г) используя неионные детергенты, д) снижая pH, что в основном ослабляет ионообменные эффекты, обусловленные положительными зарядами, возникающими при образовании изомочевинных связей с матрицей (см. рис. 4.35). Поэтому после раствора с понижающимся градиентом концентрации соли гидрофобную колонку следует промыть раствором с повышающейся концентрацией этиленгликоля на фоне низкого содержания соли. Другой способ заключается в том, что после адсорбции белков, проведенной при комнатной температуре, для градиентной элюции используют постепенное понижение температуры.
Следует отметить, что потенциальные возможности гидрофобных адсорбентов до сих пор еще не реализованы. Несмотря на отсутствие у них хроматографической избирательности в отношении сходных компонентов смеси, гидрофобные адсорбенты могут быть очень полезными при грубом разделении белков на очень ранних стадиях очистки или даже на первой стадии. Если гидрофобную хроматографию использовать в качестве быстрого метода адсорбции «в объеме», то она может заменить в некоторых случаях фракционирование сульфатом аммония, так как при этом исключается центрифугирование и получается более узкая зона, содержащая нужный белок. Это описано в следующем разделе.
«Высаливающая» хроматография
Как отмечалось выше, гидрофобная хроматография и осаждение белков высаливанием — весьма сходные процессы. Их комбинация является естественным развитием методов разделения. Еще до того, как были получены гидрофобные адсорбенты, успешно применялась методика, состоящая в том, что на колон-
186
Глава 4
ку, уравновешенную сульфатом аммония, наносили суспензию белка, полученного осаждением этой солью, и затем промывали колонку понижающимся градиентом концентрации соли [118]. Использовались нейтральные, инертные, сорбенты, такие, как целлюлоза, сефадекс и позднее агароза [119]. Однако поведение этих материалов при высокой концентрации соли нельзя назвать в строгом смысле «инертным»; по существу, они ведут се* бя во многом как гидрофобные адсорбенты.
Целлюлоза нерастворима в воде главным образом из-за своего гидрофобного характера. Атомы водорода в остатках глюкозы располагаются на поверхности кристаллов, тогда как гидроксильные группы ориентированы внутрь и образуют водородные связи с соседними молекулами. Но целлюлоза, подвергнутая специальной обработке, содержит значительное число экспонированных гидроксильных групп и может быть успешно использована в качестве «высаливающего» адсорбента [120]. Замещенные ионообменные целлюлозы адсорбируют белки, по-видимому, даже более эффективно, несмотря на то что при высокой концентрации соли ионообменные свойства их, вероятно, подавлены. Белки, связанные с такими целлюлозными матрицами, можно элюировать раствором с такой же высокой кон-центрацией соли, которая используется для их адсорбции, добавив в раствор вещества, ослабляющие водородные связи, — глицерин, сахарозу, мочевину или этанол |[120]. Отсюда следует, что в этих условиях водородные связи имеют по меньшей мере столь же важное значение для адсорбции, как и гидрофобные взаимодействия.
