Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
он
снг—сн—CH2-NH2-^ sq-
^CH2CH2CH2-NH-Cff + 2 СИ ^nh2
СОСГ
Рис. 4.53. Биполярные «ионообменные» адсорбенты на основе геля агарозы [69]. Л. Агароза, модифицированная сульфаниловой кислотой. Мало вероятно, чтобы атом азота в остатке сульфаниловой кислоты был протонирован при pH выше 4. В* Аргининагароза.
¦° СН|—СН—CHr-+NHr—
Разделение белков путем адсорбции
189*
аргининсефарозе — 8,10; поэтому вещества, формулы которых изображены на рис. 4.53, по-видимому, лучше использовать при значениях рн ниже этих величин рКа- Было показано, что на адсорбентах со смешанными функциями происходит избирательная адсорбция белков плазмы, причем емкость адсорбентов оказалась столь же высокой, как и у обычных ионообменников. Адсорбент на основе сульфаниловой кислоты обнаруживает также в некоторой степени гидрофобный характер; его можна рассматривать как сильно упрощенный структурный аналог адсорбента, модифицированного красителем (см. разд. 4.6).
Были разработаны и другие сходные адсорбенты со смешанными функциями [64—66]. В этом случае гидрофобные и гидрофильные свойства придавались аффинным лигандам, причем в процессе адсорбции наблюдалась высокая селективность. Однако очень низкая емкость этих сорбентов ограничивает их применение.
Адсорбенты на основе фенмлборной кислоты
Для очистки ферментов недавно был предложен адсорбент,, представляющий собой агарозу, связанную с фенилборной кислотой. Он функционирует благодаря образованию легко расщепляемой ковалентной связи между остатком иммобилизованной борной кислоты и чыс-гидроксильными группами растворимых соединений (рис. 4.54). Таким образом, этот адсорбент может служить общим аффинным адсорбентом, избирательно взаимодействующим с гидроксильными группами в цыс-положе-
Рис. 4.54. Реакции фенилборной кислоты с 1,2-чис-диольными соединениями, подобными тем, которые встречаются в углеводном компоненте гликопротеинов и в рибозном кольце нуклеотидов [124].
190
Глава 4
нии. Однако белки содержат такие гидроксилы только тогда, когда в их состав входят простетические группы, особенно углеводы. Следовательно, адсорбенты на основе фенилборной кислоты предоставляют альтернативный способ связывания гликопротеинов помимо более традиционного метода с использованием агарозы, модифицированной лектином.
Более интересный способ применения этого адсорбента получил название «хроматография верхом на лиганде» («piggyback chromatography») [124]. В этом случае колонку уравновешивают лигандом, содержащим гидроксильные группы, например сахаром или рибонуклеотидом, таким, как АТР или NAD. При этом лиганд с высокой плотностью, но очень непрочно (обратимо) адсорбируется на колонке {величина mt в уравнении (4.5) приближается к 10~1 М]. После этого образец наносят на колонку, и фермент, связавшись с лигандом, удерживается на ней. Поскольку связь между адсорбентом и лигандом обратима, определенная часть лиганда в каждый момент времени перемещается вниз по колонке и фермент, «сидящий верхом» на лиганде, движется вместе с ним. Перемещение лиганда иногда бывает настолько медленным, что для элюции фермента может потребоваться его избыток (или же другой лиганд).
Так как значение mt велико, высокое значение а достигается даже в случае систем с низким сродством. Например, если mt~ З'Ю-2 М, Кр = 5- 10-3 М и р*=10-4 М, то а—0,86, что характеризует вполне приемлемое удерживание и приводит к высокоспецифическому связыванию белков с выбранным лигандом. К сожалению, наблюдается неспецифическая сорбция за счет фенильного кольца, что может затруднить разделение. Детальное описание этого метода дано в буклете фирмы Amicon if 124].
4.9. АДСОРБЦИЯ «В ОБЪЕМЕ»
В некоторых простейших стадиях очистки ферментов используется адсорбция «в объеме», которая заключается в том, что хлопьевидный материал вносят в белковый раствор, часто в исходный экстракт, и белки сорбируются на нем. Для этой цели пригоден любой адсорбент, который можно быстро отделить путем осаждения или фильтрации и затем промыть. При работе с малыми количествами материала центрифугирование более удобно. Главное условие для успешной адсорбции «в объеме» — это то, что коэффициент распределения а адсорбируемых белков должен быть очень близок к единице, а многие другие белки, присутствующие в смеси, должны иметь более низкие величины а. Как видно из рис. 4.55 и табл. 4.10, концентрация свободного белка остается постоянной во всем
Разделение белков путем адсорбции 191
Рис. 4.55. Определение объемов при адсорбции белков «в объеме».
объеме и, следовательно общее количество неадсорбирован-ного белка может быть значительным, если а даже ненамного меньше единицы.
Рис. 4.55 позволяет сделать следующие расчеты. Обозначим объем свободной жидкости и объем осевшего адсорбента в двухфазной системе соответственно Vs и Va. Концентрация свободного белка р в объеме Va та же, что и в объеме Vs. Количество адсорбированного белка равно q'Va» где q — концентрация адсорбированного белка. Количество несвязанного белка можно выразить как p(Va+Vs). Коэффициент распределения а определяется как a^q/ip + q). Отсюда концентрация несвязанного белка будет p=q{ 1—а) /а. Следовательно, долю связанного белка / можно представить в следующем виде:
