Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 66

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 60 61 62 63 64 65 < 66 > 67 68 69 70 71 72 .. 145 >> Следующая

Работа с окрашенными адсорбентами
Как при любой колоночной хроматографии, целью здесь является сорбция интересующего нас белка и его последующая элюция в условиях, сводящих к минимуму загрязнения другими белками. Так как очень многие белки потенциально способны связываться с окрашенными адсорбентами, необходимо подобрать такие начальные условия, при которых сорбция других белков уменьшилась бы и в то же время весь нужный белок остался бы на колонке. Адсорбция обычно ослабе-
т
Глава 4
1М NaCI Н20
Рис. 4.48. Элюция белков с агарозы, модифицированной цибакроном голубым F3GA (неопубликованные данные автора). На колонку нанесен образец неочищенного экстракта Zymomonas mobilis в буфере с pH 6,5 (1—0,08).
Элюцию проводят солевым градиентом (прерывистая линия) до концентрации 0,4 М NaCI, затем 1 М NaCI и, наконец, водой.
вает с увеличением ионной силы; для белков способность к ионному обмену представляется более важной, чем гидрофобные взаимодействия. Следовательно, и значение pH в этом случае — более важный показатель, чем при обычной аффинной хроматографии, причем при более высоких значениях pH адсорбция ослабевает. Сочетая специфические и неспецифические взаимодействия, ферменты можно связать с адсорбентом настолько сильно, что их с трудом удается элюировать. Например, если вклад гидрофобных взаимодействий велик, повышение концентрации соли будет усиливать эти взаимодействия и противостоять вытесняющему эффекту соли, который наблюдается при ионном обмене и специфических сорбционных взаимодействиях. Использование веществ, способных ослаблять гидрофобные взаимодействия, например детергентов (тритон Х-100) хаотропных солей (LiBr, KCNS) или гликолей, может оказаться полезным при элюции таких белков. Заключительная промывка колонки водой также приводит к элюции некоторых белков (рис. 4.48).
Для аффинной элюции следует использовать истинные субстраты; хотя теоретически в этом качестве может выступать и свободный краситель, он оказывается менее специфичным. Так, для киназ используется ATP(±Mg), для дегидрогеназ — NAD+ (или предпочтительнее NADH, который более прочно связывается с большинством дегидрогеназ), для АМР-связы-вающих ферментов (например, для фруктозо-1,6-бисфосфата-
Разделение белков путем адсорбции
171
зы)—АМР. Однако, прежде чем использовать высокие концентрации дорогих лигандов, следует найти наилучшие условия для аффинной элюции. Это может быть буферный раствор, в котором фермент лишь начинает перемещаться вниз по колонке (о между 0,95 и 0,90). Добавление лиганда в концентрациях, не превышающих 10 Kl (если фермент имеет один центр связывания), или в меньших концентрациях (если существует несколько таких центров; см. рис. 4.28 и 4.29) приводит к быстрой элюции. Известно много примеров, когда для элюции фермента применялись АТР или NAD в концентрациях 10 мМ и выше просто потому, что состав элюирующего буфера не был идеальным. Такие методы оказываются совершенно непригодными при очистке больших количеств ферментов.
Было высказано предположение, что более эффективное разделение можно осуществить, используя двухколоночный метод [96]. Первая колонка должна содержать краситель, не связывающий нужный фермент. С помощью этой колонки удаляются очень сильно связывающиеся белки, которые в противном случае адсорбировались бы и занимали связывающие участки на второй колонке. Вторая колонка должна содержать краситель, имеющий высокое сродство к нужному ферменту, но относительно низкое к другим белкам. Чтобы найти оптимальные условия, необходимо провести обследование многих окрашенных адсорбентов, измеряя при этом активность фермента и содержание белка в исследуемой смеси до и после ее пропускания через колонку, а также после элюирования фермента подходящим буфером. Этот способ пригоден в тех случаях, когда для выделения необходимого фермента иными методами требуются большие количества адсорбента.
Наконец, следует отметить, что существуют белки, которые не связываются с функциональными нуклеотидами, но все же сорбируются на окрашенных носителях. Наиболее известный пример — сывороточный альбумин, но и такие белки, как фолликулостимулирующий гормон, интерферон, сывороточные ли-попротеины, фосфоглицератмутаза и фруктозо-1,6-бисфосфат-альдолаза, также связываются с этими сорбентами [93]. В двух последних случаях субстраты ферментов (соответственно 2,3-бисфосфоглицерат и фруктозо-1,6-бисфосфат) могут быть использованы для биоспецифической элюции. Весьма вероятно, что помимо нуклеотидсвязывающих белков с окрашенными адсорбентами связываются ферменты, субстратами которых служат полиаминные соединения, и эти ферменты тоже можно элюировать их субстратами.
Емкость колонки может быть очень велика, но количество нужного фермента, связывающегося с адсорбентом, будет в значительной мере зависеть от количества других ферментов,
172
Главе 4
присутствующих в смеси. Таким образом, на ранних стадиях очистки иногда требуется большое количество адсорбента, а на поздних стадиях — достаточно маленькой колонки. Сырые экстракты применяют только в том случае, если интересующие нас ферменты относятся к наиболее прочно связывающимся белкам, поскольку они будут вытеснять все белки, адсорбирующиеся менее прочно. Следует отметить, что если сырые экстракты содержат фенолы или флавины, то эти вещества также связываются окрашенными адсорбентами и может понадобиться очень тщательная отмывка, чтобы удалить все поглощающие 'в УФ-свете вещества. Здесь опять-таки необходимо использовать метод проб и ошибок. Адсорбция белков занимает много времени, и адсорбция на окрашенных адсорбентах не составляет исключения из этого правила. Необходимо достаточное время для того, чтобы установилось равновесие между раствором и матрицей. Поэтому скорость протекания раствора через колонку обычно не должна превышать 20 см/ч. Однако очень сильно сорбирующиеся ферменты можно очистить и при больших скоростях потока. Пожалуй, наиболее ярким примером в этом отношении служит очистка дрожжевой АМР-киназы [12], при которой скорость потока была равна 40 мл/мин на колонке с сорбентом «Affi-Blue» диаметром всего 2,5 см, т. е. примерно 500 см/ч. Сходные скорости потока достигались прокачиванием неочищенного экстракта дрожжей через колонку с сефарозой CL-4B, связанной с проционом НЕ-ЗВ. На колонке удерживались при этом вся глюкозо-6-фосфатдегидрогеназа и большая часть 6-фосфоглюконатдегид-рогеназы. Для столь сильно сорбирующихся ферментов можно использовать технику сорбции в объеме (см. разд. 4.9) либо применять адсорбенты, модифицированные красителями типа проционового желтого Н-А (Amicon Matrex orange) или проционового пурпурного MX-G, которые связывают белки менее прочно, чем другие окрашенные адсорбенты.
Предыдущая << 1 .. 60 61 62 63 64 65 < 66 > 67 68 69 70 71 72 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed