Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Подробные исследования поведения белков на гидроксила-патите позволили Бернарди [109] сделать заключение, что адсорбция основных белков, положительно заряженных при ис-
182
Глава 4
пользуемом значении pH, отличается от поведения нейтральных или кислых белков. Все белки, сорбированные при низких концентрациях фосфата калия, можно элюировать, повысив концентрацию фосфата, причем основные белки требуют более концентрированных буферных растворов, чем кислые. Другие соли, например КС1 и iNaC'I, не эффективны при элюции кислых белков; то же самое справедливо и в отношении СаС12 (вплоть до ЗМ концентрации). С другой стороны, основные белки элюируются хлоридами, и для вымывания с гидроксилапатита таких основных' белков, как лизоцим или рибонуклеаза, достаточно очень низких концентраций СаСЬ (1—10 мМ). Из этих опытов был сделан вывод, что кислые белки лучше всего сорбируются участками на поверхности кристаллов, занятыми ионами кальция, причем такие анионы, как С1“, не способны эффективно вытеснять эти белки, так как имеют низкое сродство к участкам, занятым Са2+. С другой стороны, основные белки связываются более прочно с ионами Р04*~ и могут достаточно эффективно вытесняться моновалентными катионами и очень эффективно — ионами Са2+, которые имеют высокое сродство к фосфат-ионам. Хотя эти теоретические и модельные опыты открывают некоторые новые возможности для разделения белков на гидроксил-апатите, реальные примеры использования селективной элюции солями весьма немногочисленны. Обычно применяемым способом остается элюция градиентом фосфатного буфера, возможно, из-за того что альтернативные способы просто игнорируются.
Недавно фирма LKB разработала новый сорбент HA-Ultro-gel, представляющий собой шарики геля, покрытые гидроксила-патитом. Этот сорбент по своим свойствам явно превосходит все другие формы гидроксилапатита: в частности, он имеет высокую (относительно) адсорбционную емкость. Детали его применения приведены в инструкции фирмы LKB [114].
Гидрофобные адсорбенты
В ходе создания носителей для аффинной хроматографии было проведено множество «контрольных» опытов, в частности изучено поведение матриц, содержащих удлиняющие «мостики» без лиганда. В большинстве случаев, как и следовало ожидать, адсорбции на таких носителях не отмечалось. Однако в некоторых случаях было обнаружено, что ферменты прочно связывались с гексаметиленовыми «мостиками», даже если они не содержали заряженных концевых аминогрупп или карбоксильных групп, которые могли бы функционировать как ионообмен-ники [115]. Эти наблюдения послужили отправным пунктом для развития методов гидрофобной хроматографии, основанных
Разделение белков путем адсорбции
183
на связывании белка в результате взаимодействия между алифатической цепью адсорбента и соответствующим гидрофобным участком на поверхности белка [116, 117]. Это и есть тот «неспецифический» вклад в аффинную сорбцию, который в наибольшей степени способствует прочному связыванию белков на носителе (см. разд. 4.5).
Хотя при низких концентрациях соли с короткими иммобилизованными алифатическими цепями связывается относительно мало белков, гидрофобную хроматографию можно распространить практически на все белки, поскольку гидрофобные взаимодействия усиливаются с повышением концентрации соли. В частности, соли, проявляющие наибольшую эффективность при высаливании (см. разд. 3.3), такие, как сульфат аммония, характеризуются наибольшим усилением гидрофобных взаимодействий. Это объясняется тем, что в основе обоих эффектов лежат одинаковые механизмы: при высаливании основной причиной агрегации служит усиление гидрофобных взаимодействий между белками. Следовательно, при высоких концентрациях соли большинство белков можно адсорбировать на гидрофобных группах, связанных с инертной матрицей (однако сама матрица может и не быть инертной; см. ниже).
К типичным гидрофобным адсорбентам, имеющимся в продаже, относятся адсорбенты, в состав которых входят линейные алифатические цепи, содержащие 4, 6, 8 и 10 атомов углерода (P. L. Biochemicals), а также адсорбенты с такими же цепями, но имеющими концевую аминогруппу (рис. 4.51,Л). Адсорбенты последнего типа предназначены преимущественно для присоединения аффинных лигандов, однако они сами по себе представляют интересные гидрофобные адсорбенты, в которых имеется группа, потенциально способная к образованию водородных связей и электростатическим взаимодействиям. Важно также отметить, что эти адсорбенты делаются на основе агарозы, активированной бромцианом, и поэтому содержат положительно заряженную группу на другом конце алифатической цепи (см. рис. 4.35). Доступны также фенилагарозы, в которых бензольное кольцо связано с матрицей через простые эфирные связи с глицерином (например, фенилсефароза; рис. 4.51,5).
Рис. 4.51. А. Структура аминогексилсефарозы (P. L. Biochemicals Aghexa-.mine). Б. Структура фенилсефарозы (Pharmacia).
184
Глава 4
Рис. 4.52. Изменения коэффициента распределения а в зависимости от концентрации соли для гипотетического ряда из пяти белков на гидрофобном адсорбенте.
