Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Как и в случае многих других методов очистки ферментов, единственный способ выяснить, пригоден ли данный метод для такой цели, — это испытать его. Адсорбции способствует низкая концентрация соли, однако необходима достаточная буферная емкость, чтобы предотвратить нежелательные локальные изменения pH вблизи высокополярной поверхности адсорбента. Элюция белков происходит при более высокой концентрации соли. Ее можно добавлять сразу в один прием или, в случае колоночной хроматографии, вводить постепенно в виде градиента.
Некоторые применявшиеся неорганические адсорбенты перечислены в табл. 4.8. Часто эти адсорбенты используют не как хроматографические материалы и даже не применяют их в обычном цикле адсорбция — элюция, а с их помощью только связывают нежелательные примеси. Системы «объемного» или
12*
180
Глава 4
Таблица 4.8. Некоторые неорганические адсорбенты, часто используемые для очистки белков
Гель окиси алюминия Су (гель и кристаллический порошок) Бентонит (силикатный порошок)
Фосфат кальция: «Состарившийся» гель Брушит
Г идроксилапатит
Окись титана
Гель гидроокиси цинка
колоночного типа могут адсорбировать различные ненужные белки, другие макромолекулы и низкомолекулярные соединения, оставляя -нужный фермент в растворе готовым для следующей стадии очистки. В качестве примера можно привести очистку дрожжевой фосфоглюкозоизомеразы (КФ 5.3.1.9) с использованием как гидроокиси цинка, так и бентонита в качестве адсорбентов «объемного» типа (табл. 4.9) [111]. Гидроокись цин-
Таблица 4.9. Очистка фосфоглюкозоизомеразы из экстракта дрожжей с помощью адсорбции примесных белков «в объеме» fill]
Белок, мг Фермента Удельная
тивная ак активность
тивность, ед.
Сырой экстракт 30 500 173 000 5,7
Обработка Zn(OH)2 6630 115 000 17,3
Обработка бентонитом 905 109 000 120
ка получают in situ, смешивая ацетат цинка и щелочь в таком соотношении, чтобы pH был около 8. На гидроокиси цинка сорбируются многие белки, но изомераза остается в растворе. После удаления геля гидроокиси с помощью центрифугирования добавляют бентонит, который сорбирует дополнительное количество белков, однако и в этом случае изомераза не связывается с адсорбентом. Бентонит состоит из очень легких студенистых частиц, так что требуется относительно высокая центробежная сила для его осаждения. Эти две стадии дают 20-кратную очистку сырого экстракта, не подвергавшегося каким-либо предварительным обработкам.
Гели гидроксилапатита и фосфата кальция
Уже в течение нескольких десятилетий известно, что гидратированные гели фосфата кальция можно успешно использовать для избирательной адсорбции белков и их последующей элюции высокими концентрациями солей. Первоначальный и до сих пор широко применяемый способ получения адсорбента состоял в том, что хлористый кальций смешивали с трехоснов-
Разделение белков путем адсорбции
181
ным фосфатом натрия и промывали гелеобразный осадок дистиллированной водой. Затем гель оставляли для «созревания» в течение нескольких месяцев; это продолжалось до тех пор, пока он не приобретал оптимальные характеристики по своей плотности [112]. Гелеобразная консистенция этого материала не позволяет применять его непосредственно в колонках из-за плохих фильтрационных параметров, однако он идеален для сорбции в объеме. Гель фосфата кальция имеет высокую емкость вследствие большой площади поверхности на единицу веса; до развития ионообменной хроматографии он широко использовался для очистки белков. Его применение незаслуженно забыто в последнее время в связи с распространением более сложных адсорбентов и производством фосфата кальция с частицами контролируемых размеров, предназначенного специально для хроматографии. Были предприняты попытки использовать этот кальций-фосфатный гель, смешанный с целитом (вспомогательный фильтрующий материал), для хроматографического разделения белков в колонках. Однако этот метод имеет мало преимуществ по сравнению с использованием кристаллического гидроксилапатита, предназначенного специально для колонок. Главное преимущество геля фосфата кальция заключается в возможности его применения для быстрой адсорбции белков св объеме».
Чтобы получить гидроксилапатит-— кристаллический, пригодный для колонок фосфат кальция, — 0,5 М растворы СаСЬ и Na2HP04 медленно смешивают с 1 М раствором Nad. При этом образуется брушит — СаНР04-2Нг0. При кипячении бру-шита с NaOH он превращается в гидроксилапатит — Са10(РО4)б(ОН)2 [113].
Кристаллические частицы в колонке адсорбируют белки на своей поверхности. Белки не могут проникать в частицы кристаллов, подобно тому как это происходит при использовании матриц на биологической основе. Поэтому адсорбционная емкость их ограниченна. В самом деле монослой типичного белка на поверхности сферических частиц диаметром 0,1 мм составляет не более 0,1 г/см3. Гидроксилапатит имеет более высокую емкость, вероятно, из-за трещин и разломов кристаллических частиц, что приводит к значительному увеличению эффективной поверхности. Все же ограниченная емкость кристаллического фосфата кальция позволяет применять его при очистке белков в основном на одной из заключительных стадий процедуры, а часто и на самой последней стадии, после того как все остальные методы не привели к получению гомогенного вещества.
