Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Разделение белков путем адсорбции
175
количеств фермента из исходной смеси. Один кролик может дать до 1—2 г иммуноглобулинов; это составляет несколько со-тен кубических сантиметров адсорбента, его достаточно для очистки по меньшей мере 10 мг фермента в каждом цикле использования колонки. Таким образом, получение достаточного количества фермента для выработки антител не представляет серьезной проблемы, особенно если колонка может быть использована несколько раз.
Заключительная стадия — элюция с колонки — часто оказывается камнем преткновения для всего процесса. Взаимодействия между антигеном и антителом характеризуются константами диссоциации порядка 10-8—10-12 М. Подставив эти значения как величины Кр в уравнение (4.5), мы получим значение а, близкое к единице. Ослабить специфические взаимодействия не просто. Хотя иммуноглобулины — весьма прочные молекулы и могут выдержать достаточно жесткие условия, необходимые, чтобы разрушить специфические взаимодействия, это не обязательно справедливо в отношении вытесняемого фермента. Так, при pH 2—3 антиген будет вытеснен, а оставшиеся на колонке антитела сохранят свою активность, так что колонку можно будет снова использовать; однако весьма вероятно, что при pH 3 фермент будет разрушен. Сходные последствия обычно наблюдаются при использовании высоких концентраций мочевины и органических растворителей с целью соответственно уменьшить число водородных связей и ослабить гидрофобные взаимодействия. Применение высоких концентраций солей может быть успешным, если наблюдаются преимущественно электростатические взаимодействия, но в этих условиях усиливаются гидрофобные связи. Хаотропные соли, такие, как тиоцианат или иодид, бромид лития, хлористый магний и так называемые деформирующие буферы, например имидазолцитрат, дают довольно хорошие результаты, но опять-таки необходимые концентрации этих веществ могут вызывать денатурацию десорбированного фермента. Была описана методика быстрой элюции денатурирующим агентом, позволяющая получить активный антиген [102]. Эта методика заключается в том, что адсорбент помещают в верхнюю часть обессоливающей колонки, и поэтому, как только фермент покидает слой адсорбента, он сразу же отделяется от элюирующего агента (рис. 4.49). При малых количествах белка контакт с элюирующим агентом не превышает 1 мин, и за это время может произойти лишь незначительная денатурация белка.
В последнее время были предложены успешные методы элюции с помощью холодной дистиллированной воды [103, 104]. В обеих работах использованы ферменты из растений. Предстоит еще выяснить, насколько общим является этот метод, по-
176
Глава 4
6М NH4CNS
Иммуноадсорбент + Связанный фермент (антиген)
Сефадекс G -25
Рис, 4.49. Удаление антигена с иммуноадсорбента с помощью хаотропной соли и быстрое отделение соли от антигена (очищаемого белка).
скольку непонятно, чем обусловлена его эффективность помимо того, что при этом существенно ослабевают гидрофобные взаимодействия. Возможно также, что благодаря низкой ионной силе возникает какое-то специфическое конформационное изменение фермента.
Другой метод удаления антигена — это электрофорез [87]. При том значении pH, при котором антиген достаточно сильно заряжен, небольшая доля этого антигена под действием электрического тока медленно перемещается с поверхности адсорбента в раствор без существенного разбавления, происходящего обычно при простом пропускании буфера через колонку. В одном из новых методов используется расщепляемый удлиняющий мостик [105]. Антитело присоединяют к агарозной матрице через сложноэфирную связь по фенольному гидроксилу. Эта связь разрывается химическим путем в имидазол-глициновом буфере при ipH 7,4 с отщеплением комплекса антиген—антитело. Этот метод, дравда, не позволяет отделить антитело от антигена, так что адсорбент можно использовать только однократно.
В идеале удаление адсорбированного фермента с колонки должно происходить в результате того, что величина константы диссоциации изменяется примерно от 10~7 до 10-4 М, т. е. благодаря 1000-кратному снижению сродства без денатурации антигена. Чтобы получить исходные значение константы диссоциации около 10“7М (вместо более обычного сродства, превышающего эту величину на несколько порядков), целесообразно варьировать источник, из которого выделяют препарат фермен-
Разделение белков путем адсорбции
177
та. Например, если хотят ,получить фермент человека, а комплекс этого фермента с антителом кролика слишком прочен, то можно сначала очистить такой же 'фермент другого животного, например лошади. Комплекс фермента лошади с полученным к нему антителом кролика будет прочным, но фермент человека не будет давать слишком сильную перекрестную реакцию с антителами к ферменту лошади. Следовательно, очистка фермента человека на колонке с антителами к ферменту лошади может оказаться более успешной. Практическое преимущество такого подхода состоит в том, что на начальных стадиях очистки можно использовать большое количество более доступного исходного материала (фермент лошади).
