Методы очистки белков - Скоупс Р.
Скачать (прямая ссылка):
Общие подходы
Простейший метод адсорбции белков «в объеме» заключается в том, что к белковому раствору добавляют адсорбент (уравновешенный подходящим буфером), размешивают суспензию в течение нескольких минут, дают адсорбенту отстояться и затем отфильтровывают его с отсасыванием. Осадок на воронке промывают буфером до тех пор, пока в промывных водах не будет обнаруживаться очень мало белка. Осадок отсасывают досуха, смешивают его с элюирующим буфером (временно прекращая
13—1078
194
Глава 4
Размешивание с адсорбентом 10-15 мин
3. Суспензию выливают на фильтр
Ши
2. Если осадок хлопьевидный, ему дают отстояться. Основную часть надосадочной жидкости декантируют
4. Промывают 5. Отсасывают досуха, 6. Адсорбент исходным буфером ополаскивают колбу суспендируют
7. Отсасывают досуха и повторяют элюирующем буфере операцию 6
Рис. 4.56. Проведение адсорбции белков «в объеме* и последующей элюции.
отсос) и оставляют на несколько минут. Иногда лучше перенести адсорбент с элюирующим буфером в стакан, чтобы удобнее было размешивать его в течение нескольких минут, а затем суспензию вновь перенести на воронку. Тем временем сборник фильтрата следует тщательно вымыть и высушить перед тем, как начать отсасывание элюирующего буфера. Эту процедуру затем повторяют и в конце, не размешивая осадок, пропускают дополнительный объем буфера, чтобы обеспечить полную отмывку всего десорбированного фермента. Объем каждой порции элюирующего буфера должен быть равен 1—2 объемам осадка. На рис. 4.56 представлена схема этого процесса.
Иногда приходится усложнять описанную процедуру для улучшения результатов очистки. Например, в смеси могут присутствовать белки, адсорбирующиеся прочнее, чем требуемый фермент, так что последний совсем не связывается с первой порцией внесенного адсорбента. В этом случае следует удалить первые порции адсорбента, прежде чем добавлять новые порции, адсорбирующие фермент (рис. 4.57). Можно провести
Разделение белков путем адсорбции
№
Рис. 4.57. Измерение ферментативной активности, остающейся в растворе после последовательного добавления порций адсорбента, позволяет проводить адсорбцию в оптимальных условиях. В этом примере сначала добавляют 20 см3 адсорбента, который затем удаляют. После этого добавляют еще 30 см3 адсорбента для связывания ферментного белка.
пробные опыты на небольших количествах материала, чтобы найти оптимальные объемы порций адсорбента.
Элюцию тоже можно осуществлять ступенчато, чтобы ненужный материал выходил в первых порциях элюата, и лишь потом добавлять буфер, элюирующий требуемый фермент. Пробные опыты опять-таки позволяют найти оптимальные условия (рис. 4.58).
Рис. 4.58. Ступенчатая элюция, проводимая с целью найти оптимальный способ извлечения фермента.
В этом примере большая часть фермента элюируется при концентрации соли выше 20 мМ. Вероятно, наилучшие результаты будут получены, если осадок
1) промыть 20 мМ раствором соли для удаления примесных белков и
2) дважды промыть его 50—60 мМ раствором соли, чтобы получить большую часть фермента, не слишком сильно загрязненного неспецифическими белками.
Концентрация соли в элюирующем буфере, мМ
13*
196
Глава 4
К типичным материалам, используемым для адсорбции белков «в объеме», относятся гель фосфата кальцйя, ионообменни-ки (особенно фосфоцеллюлоза), аффинные адсорбенты, адсорбенты, модифицированные красителями, гидрофобные адсорбенты и иммуноадсорбенты.
В гл. 2 уже обсуждались способы отделения белков от других нежелательных веществ, таких, как камеди и другие углеводы, присутствующие в капсулах микроорганизмов, с помощью гидрофобной или высаливающей адсорбции.
Вследствие того что адсорбция белков «в объеме» — это быстрый метод, позволяющий обрабатывать большие количества материала, его следует иметь в виду при любых операциях по выделению веществ с применением адсорбентов. Сейчас производится столько разных типов адсорбентов, например адсорбенты, модифицированные красителями, что вероятность существования адсорбента с подходящими для данного фермента характеристиками весьма велика. Если такой адсорбент применять на стадии неочищенного экстракта, это сэкономит много времени и избавит от необходимости приобретать оборудование для крупномасштабной работы.
РЕКОМЕНДУЕМАЯ ЛИТЕРАТУРА
Amicon Corporation publications (1980). Dye-ligand chromatography: Applica: tions, method, theory of Matrex gel media, Lexington, Mass.
Gribnau Т. С. IVisser Nivard R. I. F. (eds.) (1982). Affinity chromatograp-
hy and related techniques, Elsevier, Amsterdam.
Jackoby W. jB. (ed.) (1974). Affinity techniques: Enzyme purification, part B. In: Methods in Enzymology, vol. 34, Academic Press, New York.
Lowe C. R. (1979). An introduction to affinity chromatography. In: Laboratory techniques in biochemistry and molecular biology (Work T. S. and Burdon R. H., eds.), voL 7, Part II, EIsevier/North-Holland, Amsterdam.
Lowe C. R.f Dean P. D. G. (1974). Affinity chromatography, Wiley, London. Peterson E. A. (1970). Cellulosic ion exchangers (Work T. S. and Burdon R. H., eds.), vol. 2, Part II, Elsevier/North-Holland, Amsterdam.
