Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Скоупс Р. -> "Методы очистки белков" -> 67

Методы очистки белков - Скоупс Р.

Скоупс Р. Методы очистки белков — М.: Мир, 1985. — 358 c.
Скачать (прямая ссылка): metodiochistkibelkov1985.djvu
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 145 >> Следующая

Хроматография на окрашенных адсорбентах — быстро развивающаяся область; просматривая при подготовке этой главы новые публикации, в том числе и работы моей лаборатории, я убедился в том, что об этом методе следует подумать, прежде чем приступать к реализации плана очистки того или иного фермента, особенно если этот фермент связывает нуклеотиды. Что касается цибакрона голубого, то он, по-видимому, ничем особенным не отличается от других красителей; по своей способности связывать белки он попадает в середину ряда красителей. Широкое распространение окрашенных адсорбентов обусловлено двумя важными факторами: а) их относительно -высокой связывающей емкостью и б) дешевизной. Если это играет важную роль для решения данной проблемы, хрома-
Разделение белков путем адсорбции
173
тографию на окрашенных адсорбентах, безусловно, следует испытать, прежде чем использовать обычные аффинные адсорбенты.
4.7. ИММУНОАДСОРБЕНТЫ
Абсолютно специфическим адсорбентом для любого фермента или белка является антитело к этому белку, связанное с нерастворимой матрицей. Антитела высокоспецифичны и имеют очень высокое сродство к тем белкам, против которых они получены. Следовательно, на колонке с соответствующим иммуноадсорбентом можно, как правило, осуществить гораздо более избирательную сорбцию, чем на аффинном адсорбенте любого другого типа; иммуноадсорбенты, представляющие собой специализированные биоспецифические адсорбенты, описаны в разд. 4.5.
Поскольку получение антител — это сложный процесс, им-муноадсорбционные колонки до сих пор еще не нашли широкого применения. Однако новая технология получения моноклональных антител может революционизировать этот способ очистки ферментов. Ниже мы сначала расскажем о методах и проблемах, связанных с применением обычных поликлональных антител, а затем кратко наметим пути преодоления большинства возникающих при этом трудностей.
Основные принципы
Эти принципы заключаются в следующем:
1. Фермент, выделенный из источника, эволюционно далекого от иммунизируемого животного (обычно кролика), очищают традиционными методами.
2. Для получения антител к этому ферменту кролика иммунизируют с использованием обычной для этой цели техники. Взятие крови у кролика и определение в ней антител осуществляются методами иммунопреципитации, двойной диффузии или значительно более чувствительным радиохимическим методом, который состоит в выявлении комплексов антиген — антитело с помощью 1251-меченого «белка А» (один из белков Staphylococcus aureus, прочно связывающийся с цепями иммуноглобулина IgG [99]).
3. Антитела из сыворотки крови кролика частично очищают (обычно достаточно осаждения сульфатом аммония при 33%-ном насыщении).
4. Антитела связывают с адсорбентом, например с активированной бромцианом или тозилхлоридом агарозой (разд. 4.5).
174
Гллва А
5. Сырой или частично очищенный препарат фермента пропускают через колонку с антителами. Колонку промывают.
6. Фермент элюируют.
Трудности обычно возникают на стадиях 1, 2 и 6. Мы будем исходить из того, что стадия 1 осуществлена и выделен по крайней мере частично очищенный фермент. Чтобы вызвать у кролика образование большого количества антител, достаточно менее одного миллиграмма чистого фермента. Поддержание высокого титра антител в крови достигается повторными ежемесячными инъекциями по 0,1—0,3 мг фермента. Однако некоторые белки значительно более антигенны, чем другие, так что даже следы их примесей в препарате фермента, не определяемые обычными аналитическими методами (разд. 9.1), могут вызвать весьма интенсивное образование антител у кролика. Впоследствии эти антитела будут связываться со своими антигенами, присутствующими в больших количествах в неочищенных препаратах фермента. Таким образом, селективность полученных антител окажется значительно более низкой, чем ожидалось. Эта проблема приобретает особую остроту, если очищаемый фермент является относительно слабым антигеном.
Один весьма успешный способ преодоления этой трудности заключается в отделении нужного фермента от других белков с помощью гель-электрофореза [100]. Образец фермента наносят на довольно крупнопористый гель и электрофорез продолжают до тех пор, пока фермент четко не отделится от всех сопутствующих примесей. После локализации положения фермента в геле последний разрезают и слой, содержащий фермент, растирают до получения тонкой суспензии, состоящей из полиакриламидного геля и фермента. Эту суспензию и используют затем для первой инъекции; нескольких сотен микрограммов белка оказывается вполне достаточно. Иммуноглобулины, полученные таким способом, содержат до 10% антител к нужному ферменту. Остальные 90% — это относительно неспецифические иммуноглобулины, присутствующие в организме животного к моменту иммунизации. К 1 см3 агарозы можно присоединить десятки миллиграммов иммуноглобулина [101]. При этом на 1 см3 геля будет приходиться до 1 мг специфических антител. Но, поскольку молекулы антител присоединяются к адсорбенту таким образом, что это приводит в большинстве случаев к потере их способности связывать антиген, концентрация активных антител будет составлять, вероятно, лишь около 0,1 мг/см3. Если каждая молекула этих антител связывает одну молекулу антигена с близким значением молекулярной массы, то емкость такой колонки будет порядка 0,1 мг/см3, это небольшая, но вполне достаточная емкость для очистки малых
Предыдущая << 1 .. 61 62 63 64 65 66 < 67 > 68 69 70 71 72 73 .. 145 >> Следующая

Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed