Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
3- фосфатдегидрогеназы по убыли
субстрата. Результаты опытов, приведенные на рис. 3, показывают, что при
крайне низких концентрациях кофактора, близких к концентрации ферментов,
активностью обладают только тетра-мерные формы глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназы, а мономер полностью неактивен. Вероятно, сродство к
кофактору у мономера значительно ниже, чем у тетрамера, и неспособность
связать НАД
90
не позволяет ему осуществить катализ. Иная картина наблюдается при
концентрациях кофактора 20-60 мкМ, так как в этом случае мономер не
только обладает активностью, но и катализирует реакцию в 1,5-2,0 раза
более эффективно, чем тетрамер. Мы полагаем, что большая каталитическая
эффективность мономера в этом случае обусловлена его меньшим сродством к
кофакторам: поскольку фосфоролиз ацил-фермента невозможен без отщепления
НАДН, облегчение последнего процесса должно приводить к ускорению
реакции. При невысоких концентрациях НАД в среде отщепление НАДН от
фермента и его замена на НАД более эффективно могут осуществляться на
мономерах, обладающих меньшим сродством к кофакторам. При избытке НАД
вытеснение НАДН из моно- и тетрамеров происходит одинаково эффективно, и
отличий в их активности обнаружить не удается. Вероятно, в данном случае
основным преимуществом тетрамерной структуры является более прочное
связывание кофактора и, как следствие, меньшая зависимость каталитической
активности фермента от концентрации НАД в среде.
Несколько иная ситуация была обнаружена нами при сравнении свойств
иммобилизованных моно- и тетрамеров глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы
из скелетных мышц кролика. Для этого фермента характерна выраженная
отрицательная кооперативность по связыванию НАД: первая молекула НАД
связывается с тетрамером мышечной дегидрогеназы с Kd 10-п-10~8 М (по
данным разных авторов и при определении различными методами), а
последняя, четвертая молекула НАД - с Kd Ю-5 М [25, 26]. Величина Кт для
этого фермента в отношении НАД близка к значению последней константы - 1-
5-10-5 М [27]. По последним данным Бойера [28], катализ происходит именно
в тех активных центрах, которые содержат прочносвязанный НАД, а после
образования ацил-фермента в этих центрах наступают конформацион-ные
изменения, приводящие к увеличению сродства в активном центре соседней
субъединицы. Вероятно, причиной расхождений в величинах Kd и Кт являются
постоянные конформационные изменения, приводящие к изменению сродства к
кофакторам в ходе катализа и влияющие на скорость лимитирующих катализ
стадий.
Указанные выводы были сделаны при исследовании тетрамеров
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из мышц, а какая ситуация
наблюдается для мономерных форм? Определение величин Кт для
иммобилизованных тетрамеров и мономеров дегидрогеназы показывает, что в
отношении НАД они значительно отличаются: соответственно 0,077±0,002 и
0,025+0,003 мМ. Для 3-фосфогли-церинового альдегида Кт одинаковы и равны
0,2 мМ. Причиной отличий может быть увеличение сродства к кофактору у
мономерной формы и, следовательно, снижение Kd- Однако нами было
показано, что при добавлении 50-кратного молярного избытка НАД к
препарату иммобилизованных мономеров после 10-минутной инкубации и
последующего отмывания избытка кофактора ие происходит его связывания с
мономерами, тогда как с иммо-
91
билизованными тетрамерами НАД связывается при добавлении в эквимолярном
количестве. Таким образом, в иммобилизованных мономерах глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика сродство к кофактору
значительно снижается, а Кт уменьшается. Это приводит к сближению величин
Кт и Kd для кофактора, которые у исходных тетрамеров отличаются на 3- 5
порядков.
По-видимому, биологический смысл образования четвертичной структуры с
кооперативными взаимодействиями между активными центрами в данном случае
и заключается в создании фермента, обладающего сильно отличающимися
значениями Кт и Kd Для кофактора. Такая особенность позволяет, с одной
стороны, крайне прочно связывать кофактор в двух из четырех активных
центров,, что обеспечивает эффективную конкуренцию за НАД с другими
дегидрогеназами и высокую стабильность молекулы фермента, а с другой -
эффективно осуществлять катализ (практически так же, как и в мономерной
форме). Кооперативные взаимодействия между субъединицами позволяют
создать ферментативную систему, в минимальной степени зависящую от
концентрации НАД. Учитывая, что глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
катализирует центральную стадию гликолиза, на которой возникает первое
макроэрги-ческое соединение, а НАД эффективно используется в целом ряде
конкурирующих процессов, указанный механизм должен играть важную роль в
обеспечении эффективного функционирования энергетического обмена.
Из результатов работ по получению и исследованию свойств
иммобилизованных мономеров НАД-зависимых дегидрогеназ можно прийти к
однозначному выводу, что для осуществления каталитического акта
