Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
носителе, содержащем •ГТФ [6, 7]. Примерно в то же время был обнаружен
катализируемый субъединицей А\ холерного токсина перенос [32Р] АДФ-ри-
бозы от [з2Р] НАД+ на мембранный белок, который при денатурирующем
электрофорезе дает меченый полипептид с молекулярной массой 42 000-45 000
дальтон [11, 24-27].
В ряде работ была доказана идентичность этого АДФ-рибо-зилируемого
полипептида и полипептида, сорбирующегося на ГТФ-содержащих носителях и
восстанавливающего чувствительность каталитического компонента
аденилатциклазы к гуанило-вым нуклеотидам и фториду [13, 16, 24, 26, 28].
Затем в мембранах клеток лимфомы 549, клеток крысиной гепатомы, в
фибробла-стах легких, а также в тимусе было обнаружено специфическое
включение метки в присутствии холерного токсина в полипептид с
молекулярной массой 52 000 дальтон [11, 26, 29], который по биологической
функции был похож на полипептид с молекуляр-лой массой 42 000 дальтон
[29].
При очистке N-белка из печени кролика [14] и эритроцитов индюка [15],
осуществленной в лаборатории Джилмана, биоло-
"б
гическую активность N-белка проверяли по реконструкции регулируемой
аденилатциклазы с мембранами клеток сует, содержащими каталитический
компонент аденилатциклазы. Полученный высокогомогенный N-белок из печени
кролика состоял из трех полипептидных цепей с молекулярной массой 52 000,
45 000 и 35 000 дальтон, а N-белок эритроцитов - из двух полипептидов
массой 45 000 и 35 000 дальтон. Молекулярная масса неденатури-рованного
N-белка, не подвергавшегося действию активаторов, при гидродинамическом
измерении равнялась 70 000 и 81 000 дальтон соответственно. Если же
гидродинамическое определение массы /V-белка проводилось в неочищенных
детергентных экстрактах, то, по данным ряда авторов, она равнялась 126
000-130 000 дальтон [16, 17]. Полученные результаты свидетельствуют о
том, что Л/-белок является мультисубъединичным олигомером, у которого еще
не установлены количество и численное соотношение субъединиц.
По-видимому, биологическую функцию эффекторного белка аденилатциклазы
выполняют полипептиды с молекулярной массой как 42 000-45 000, так и 52
000 дальтон. Это следует из наличия реконструктивной активности у фракций
очищенного N-белка из печени кролика, обогащенных первым или вторым
полипептидами [14]. Кроме того, биологической активностью обладают
суммарные фракции TV-белка из тех мембран, в которых при АДФ-рибо-
зилировании метка включается или в полипептид с массой 45 000 дальтон
[16, 28], или в полипептид с массой 52 000 дальтон [26, 29]. Для обоих
полипептидов не было обнаружено существенных различий в способности
активироваться под воздействием фторида или гуанозин-5'-(Р3-
тиотрифосфата) (ГТФ yS) [14]. Они одинаково хорошо подвергались АДФ-
рибозилированию под воздействием холерного токсина [30]. Их пептидные
карты существенно перекрываются [31]. Коопер с сотр. сделали
предположение о том, что модулируемые ГТФ регуляторные белки, в том числе
и N-белок, содержат одинаковые домены, узнающие холерный токсин, а
процесс АДФ-рибозилирования изменяет характер их взаимодействия с
гуаниловыми нуклеотидами [32]. Нортрап с сотр. считают, что биологическая
функция полипептида с массой 35 000 дальтон [14, 15] заключается в
ингибировании активности полипептидов с массой 45000 и 52 000 дальтон и
что для активации Л'-б ел ка необходима диссоциация составляющих его
субъединиц [33].
Молекулярная масса рецепторов и их взаимодействие
с /V-белком
Наиболее изученный из рецепторных белков, связанных с аденил-атциклазой,
- p-адренергический - имеет, по-видимому, также олигомерное строение.
Молекулярная масса полипептидов из мембран крысиных миобластов [34] и
эритроцитов индюка [35] составляет 32 000-41 000 дальтон, что меньше
массы нативного ре-
4 Заказ 423
97
цепторного белка эритроцитов индюка (90 000 дальтон)' [36] и клеток
лимфомы S49 (72 ООО дальтон) [4].
Весьма важным является тот факт, что определяемая молекулярная масса
(3-рецептора существенно зависит от типа связанного с ним лиганда. В
эритроцитах лягушки [37] он увеличивается в том случае, если мембраны
перед солюбилизацией обрабатывают агонистом. В присутствии антагониста
или в отсутствие лиганда увеличения молекулярной массы p-рецептора не
происходит. Индуцированные агонистом изменения рецептора не объясняются
образованием комплекса R-С2 [3]. Лимбирд с сотр. показали, что связанный
с меченым агонистом рецептор ретикуло-цитов крыс при гель-фильтрации
элюируется вместе с [32Р] АДФ рибозилированным N-белкои
аденилатциклазного комплекса [12]. Таким образом, агонист способствует
физическому сопряжению fi-рецептора с N-белком и комплекс Н-R-N
существует более или менее длительное время, достаточное для его
обнаружения. Это явление распространяется, по крайней мере, на
глюкагоновый рецептор печени крыс [38, 39] и на а-адренергический
рецептор тромбоцитов [40].
Молекулярная масса каталитического белка
