Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
ним способны взаимодействовать несколько эффекторов, и такие из них, как
гуаниловые нуклеотиды, анионы фтора и АДФ-рибозилтрансферазы [102], могут
вмешиваться в регуляцию аденилатциклазной активности на уровне /V-белка,
минуя рецептор.
Взаимодействуя с /V-белком, такие эффекторы вызывают обратимые
изменения его физического состояния. Так, на содержащих p-рецептор
аденилатциклазных системах эритроцитов было показано, что активация
аденилатциклазы катехоламинами сопровождается высвобождением связанных с
/V-белком гуаниловых нуклеотидов и одновременным связыванием экзогенных
нуклеотидов. Например, при оккупации p-рецептора агонистом происходит
высвобождение из мембран [3Н] GppNHp или [3Н] ГДФ после предварительной
инкубации с мембранами [3Н] GppNHp [103- 105] или [3Н] ГТФ [104], а также
эндогенно связанного ГДФ [95, 104]. С другой стороны, прочная активация
аденилатциклазы под действием G/?/?NH/? снижается, если отмытые от
избытка GppNHp мембраны проинкубировать с ГТФ, ГМФ или АТФ в присутствии
р-агониста [105-108]. Иными словами, катехоламины стимулируют обмен
нуклеотидов в нуклеотид-связывающем центре /V-белка. По-видимому,
найденное на р-адренергических системах влияние гормонов на /V-белок
является ключевым и для других гормон-зависимых аденилатциклазных систем.
Подтверж-
fOS
дением этому служат недавно полученные данные о том, что в эритроцитах
индюка аденозин, действующий через аденозиновый рецептор /?-типа, также
стимулирует вытеснение из мембран ГДФ в присутствии ГМФ и освобождает
нуклеотидный центр белка для активации под действием GppNHp. При этом,
по-видимому, общий набор N-белков участвует в стимуляции аденилатциклазы
аденозиновым и катехоламиновым рецепторами [109]. Молекулярной основой
для наблюдаемых изменений скорости нуклеотидного обмена, возможно, служат
индуцируемые при взаимодействии комплекса "p-рецептор - агонист" с N-
белком изменения физического состояния N-белка. В пользу такого
предположения свидетельствует обнаруженный в лаборатории Джилмана факт
обратимого изменения под влиянием р-агониста картины протеолити-ческого
расщепления [32Р] АДФ-рибозилированного N-белка мембран эритроцитов
[110].
Гуаниловые нуклеотиды и фторид также изменяют состояние N-белка.
Показано, что после освобождения от ГДФ и связывания ГТФ vS У фракции N-
белка из эритроцитов голубя, почти полностью свободной от каталитического
белка, коэффициент седиментации уменьшался от 5,5 до 3,4 S [28]. В
лаборатории Джилмана наблюдали уменьшение массы N-белка,
солюбилизированного из мембран клеток S49, от 130 000 до 90000 дальтон
при активации ГТФ уS или фторидом и восстановление прежней массы после
удаления эффекторов [17]. Этот феномен был показан и при измерении
гидродинамических характеристик высокогомогенного N-белка. После
активации эффекторами молекулярная масса N-белка из печени кролика
уменьшалась от 70 000 до 50 000 дальтон [14], а N-белка из эритроцитов
индюка - от 81000 до 50 000 дальтон [15]. Эти факты могут указывать либо
на диссоциацию N-белка на субъединицы в результате действия лигандов-
эффекторов, либо на конформационный переход с аномальным изменением в
результате этого кажущейся молекулярной массы. Предварительные данные об
ингибирующей функции, выполняемой в N-белке полипептидом с массой 35000
дальтон [33], могут свидетельствовать в пользу первого предположения; они
дали исследователям возможность сделать вывод о том, что активация
полипептида с массой 45 000 дальтон происходит после отделения от нее
ингибирующего полипептида с массой 35 000 дальтон.
Индуцированные гуаниловыми нуклеотидами изменения физического
состояния N-белка эритроцитов голубя обнаруживали также по изменению
характера протеолиза трипсином 32Р АДФ-рибозилированного
мембранносвязанного N-белка [ПО]. Эти изменения выражались в уменьшении
прочности связи протеолитиче-ских фрагментов с мембранами и появлении
вместо нескольких минорных фрагментов крупного полипептида с молекулярной
массой 41 000 дальтон. Они происходили также в мембранах эритроцитов
человека, в которых рецептор и каталитический белок практически
отсутствуют, а значит, не были связаны с белок-белковым
106
взаимодействием между рецептором и TV-белком, TV-белком и каталитическим
белком.
Взаимодействуя с TV-белком, гуаниловые нуклеотиды, фторид и ионы
магния вызывают прочную ассоциацию N-белка с каталитическим белком, что
также свидетельствует об изменении физического состояния TV-белка. Так,
методом молекулярных мишеней было показано, что в мембранах эритроцитов
индюка в присутствии фторида или GppNHp, а также Mg2+ размер
аденилатциклаз-ной мишени увеличивается на 130 000 дальтон [36]. Эти же
эффекторы в присутствии Mg2+ могут стабилизировать взаимодействие TV-
белка с акцепторными мембранными препаратами аденилатциклазы из клеток
сус~ и UN С в процессе реконструкции [111- 113] и взаимодействие его с
солюбилизированным каталитическим белком, что отражается в увеличении
