Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
молекулы нуклеотида также имеет определенное значение для сродства [33].
В пользу высокого сродства регуляторного участка N-белка к азотистому
основанию свидетельствует отсутствие активирующего действия в отличие от
ГТФ, у ЦТФ, УТФ и 2-аминопурин-рибозидтрифосфата [116]. Прямым методом
показано также, что ИТФ имеет к регуляторному центру меньшее сродство,
чем ГДФ
[33]. По-видимому, положения 2 и 6 пуринового основания особенно значимы
для сохранения сродства, так как введение по.
110
\
этим положениям заместителей в молекуле GppNHp значительно уменьшает
активирующие свойства нуклеотида и его способность связываться с
плазматическими мембранами эритроцитов [133].
Установлено пока одно условие, достаточное для выполнения нуклеотид-
связывающим центром активирующей функции. Оно заключается в присутствии
"у-фосфата в молекуле гуанилового нуклеотида. Причем механизм активации
не предполагает использование этого фосфата для фосфорилирования или
пирофосфори-лирования, так как нуклеотиды с негидролизуемыми и у-р-свя-
зями не только не вызывают меньшего по сравнению с ГТФ активирующего
эффекта, но, наоборот, активируют аденилатцикла-зу в несколько раз лучше,
чем ГТФ. ГДФ имеет хотя и меньшее ¦сродство к регуляторному центру N-
белка, чем ГТФ, GppNHp или ГТФуЭ [33], однако вполне достаточное для
довольно прочного связывания нуклеотида. Пр и этом ГДФ в большинстве аде^
нилатциклазных систем ингибирует стимуляцию аденилатциклазы с помощью
GppNHp [92, 93, 134] или катехоламинов [135]. ГДФ, в отличие от ГТФуЭ, не
вызывает активированного состояния у гомогенного А/-белка [14, 15] и в
процессе реконструкции частично очищенного N-белка с каталитическим
белком не вызывает активации сам [125] и останавливает активацию,
происходящую под действием GppNHp [136]. Гуанозин-5'-(а, р-метилен)
дифосфат (СрСНгр) ингибирует базальную и стимулируемую аденилатци-клазную
активность в мембранах печени крыс [137]. ГДФ и ГДФрБ, в отличие от
нуклеозидтрифосфатов, препятствуют ассоциации N-белка с каталитическим
белком [10, 27, 28, 125]. Эндогенно связанный ГДФ до тех пор, пока не
будет вытеснен из нук-леотид-связывающего центра, мешает проявлению
воздействия гуанозинтрифосфатов на связывание агониста с p-рецептором и
на активацию аденилатциклазы в эритроцитах голубя [95].
Для наблюдаемого в ряде мембранных систем [67, 74, 138, 139] слабого
активирующего действия на аденилатциклазу ГДФ и ГДФрБ характерным и общим
наблюдением является увеличение лишь стимуляции под действием гормона и
ингибирование в отсутствие гормонов ГТФ- или GppNHp-зависимой стимуляции.
Возможно, что во всех этих случаях активирующее действие ГДФ и ГДФрБ
объясняется увеличением под действием этих нуклеотидов степени
сопряженности гормон-рецепторного комплекса с N-белком. Это предположение
подтверждается тем, что действие гуа-ниловых нуклеотидов на рецептор
находится под одинаковым контролем со стороны ГДФ и ГТФ в некоторых
аденилатциклазных системах [70, 79, 84, 86].
Однако точная роль, которую играет Y-фосфат в изменениях N-белка, не
известна.
Особый интерес исследователей привлекает до сих пор не расшифрованный
механизм активации А^белка под действием фтор-анионов. Фтор-анионы
вызывают такие же изменения гидродинамических параметров N-белка, как
негидролизуемые гуанило-вые нуклеотиды [14, 15, 17], что приводит к
ассоциации А/-белка
in
с каталитическим белком и активации каталитической субъединицы. Mg2+
увеличивает эффект фторида на мембранах [81] во время реконструкции
[111]. Йенгр и Бирнбаумер [118] показали, что Mg2+ абсолютно необходим
для фторидной стимуляции, так же как и для нуклеотидной. Однако есть
данные о том, что фто-ридная активация соответствует менее устойчивым
изменениям А^белка, чем нуклеотидная. Так, в растворе активация
гомогенного А'-белка из печени кролика фторидом, в отличие от активации
под действием ГТФ-yS, обращается при удалении ионов фтора гель-
фильтрацией [14]. Тиол-восстанавливающие агенты уменьшают степень
ассоциации N-белка с каталитическим белком, вызываемую фторидом, но не
GppNHp [57]. Нестабильность фторидной активации в растворе явилась
причиной уменьшенной молекулярной массы фтор-активированной
аденилатциклазы по сравнению с молекулярной массой GppNHp-активированного
фермента [58, 59].
Различия двух видов активации N-белка следуют также из того
наблюдения, что модификация N-белка АДФ-рибозилирова-нием увеличивает
ГТФ-зависимую стимуляцию аденилатциклазной активности и в то же время
ингибирует фторидную активацию [24, 72, 103, 140]. Причем для
ингибирования фторидной стимуляции требуется большая глубина модификации
А/-белка, чем для появления высокой ГТФ-зависимой активации.
Фторид, по-видимому, может стимулировать N-белок, не занятый
гуаниловыми нуклеотидами, так как после обработки мембран эритроцитов
индюка ЭДТА в присутствии изопротеренола, вытесняющей гуаниловые
