Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
размера аденилатциклазного комплекса, определяемого гель-фильтрацией и
центрифугированием в градиенте плотности сахарозы [28, 51, 57, 58].
Характерной чертой активации TV-белка является наличие медленной
стадии, которая проявляется в виде лаг-периодов на графиках накопления
продукта реакции. Исследователи, пытаясь установить природу медленной
кинетики, приходят к заключению, что основной вклад в нее вносят
медленные изменения конформации N-белка или способа взаимодействия его
субъединиц. Так, работы, проведенные в лабораториях Джилмана [14, 15],
Шрамма [88], Нир [10] и других, показали, что активация индивидуальных
фракций TV-белка гуаниловыми нуклеотидами или фторидом растянута во
времени на десятки минут. В ходе реконструкции с каталитическим белком
лимитирующей стадией является как раз активация TV-белка, а не процесс
взаимодействия TV-белка с каталитическим или следующие за этим
конформационные изменения каталитического белка [10, 88, 113]. Исходя из
такого предположения, Бирнбаумер считает [114], что аденилатциклазу можно
отнести к гистерезисным ферментам [115]. Однако возможно, что и другие
медленные процессы, такие, как вытеснение эндогенного ГДФ из комплекса с
TV-белком в эритроцитах индюка [95, 109], тоже имеют значение для
возникновения лаг-периодов. Здесь следует отметить, что медленная стадия
обычно находится под контролем гормона [92-95, 107, 116, 117] и ионов
Mg2+ [118]. В определенных условиях она появляется при активации
.фермента под действием ГТФ [118]. Длительность лаг-периода может
зависеть от химического строения активирующего нуклеотида [56, 119].
Регуляторный и активный центры
аденилатциклазного комплекса
Центры связывания эффекторов на Д'-бепке
В 1982 г. появилось сообщение из лаборатории Джилмана [33] о прямом
исследовании нуклеотид-связывающего регуляторного центра TV-белка.
Значение этого события можно оценить, если
107
принять во внимание, что до сих пор о наличии этого центра
свидетельствовали лишь сродство неочищенных фракций TV-белка к аффинным
ГТФ-содержащим носителям и способность элюироваться с этих носителей
другими гуаниловыми нуклеотидами [6, 7, 116], а также ковалентное
включение [3Н]Р3-(4-азидоанилид)Р1-ГТФ в N-белок мембран эритроцитов
голубя [75].
Однако непосредственное изучение регуляторного участка неочищенного
TV-белка по взаимодействию с ним меченых нуклеотидов было связано с
методическими трудностями. Только около 1-5% мест связывания [3Н] GppNHp
в плазматических мембранах являются специфическими по отношению к
аденилатциклазной системе [6, 66, 105]. Взаимодействующую с TV-белком
фракцию [3Н] GppNHp удавалось вычленить лишь в мембранах эритроцитов,
вытесняя меченый нуклеотид изопротеренолом в присутствии ГТФ [105], и в
мембранах из сердца собаки, где неспецифически связанные нуклеотиды
высвобождались после обработки мембран аденилил-5-имидодифосфатом в
присутствии пропранолола, ЭДТА и GppNHp [120].
При изучении активации высокогомогенного TV-белка, которая происходила
параллельно связыванию [35S]F^yS, удалось обнаружить только один класс
связывающих участков [33]. Их концентрация равнялась 0,34 моль на моль
TV-белка. Учет возможной денатурации TV-белка позволил исследователям
сделать заключение о том, что одна молекула TV-белка содержит один
нуклеотид-связывающий центр. Использование меченого по фосфору азида ГТФ
( [y32P] -8-N3 ГТФ) позволило прямо показать, что нуклеотид-связывающий
центр расположен на субъединицах с молекулярной массой 45 ООО и 52 ООО
дельтон, но не на полипептиде с молекулярной массой 35000.
По конкуренции различных нуклеотидов с [35S] ГТФ^ за регуляторный
центр установлен порядок сродства нуклеотидов: ГТФ YS > ГТФ > GppNHp >
ГДФ >8-Ы3ГТФ"ИТФ>ГМФ.
Эти данные, полученные на высокогомогенном TV-белке, довольно хорошо
соответствуют данным о порядке сродства нуклеотидов к малоочищенным
препаратам TV-белка. Они получены косвенными способами по конкуренции за
активацию аденилатциклазы неактивирующих нуклеотидов с активирующими [69,
72, 121], по конкуренции нуклеотидов со специфически связанной с TV-
белком фракцией [3H]G/?pNH/? [120] и по эффективности элюции TV-белка с
ГТФ-содержащего носителя различными нуклеотидами [28].
Кроме центра связывания гуаниловых нуклеотидов TV-белок содержит также
участок, подвергающийся АДФ-рибозилированию. По аналогии со строением
небелковых и некоторых белковых субстратов, способных участвовать в
реакции АДФ-рибозилирования [122], а также по ингибированию реакции АДФ-
рибозилирования TV-белка метиловым эфиром L-аргинина [123] можно
предполагать, что этот участок содержит остатки аргинина. Несомненным
является тот факт, что два вышеуказанных участка различны, хотя и
находятся на одной и той же субъединице TV-белка
108
\
[32]. Об этом свидетельствуют наличие сродства к ГТФ-содержа-щим
носителям у АДФ-рибозилированного TV-белка [24, 27], а также возможность
