Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
включения АДФ-рибозы в полипептиды 42 ООО и 47 ООО дальтон из печени крыс
после связывания с ними [3Н]GppNHp [123]. Однако точная локализация этого
участка не известна.
Отсутствуют сведения также о расположении катионных локу-сов TV-
белка, чувствительных к нефизиологическому активатору, фтор-аниону [124].
В ранних работах на основании различий активации аденилатциклазы под
действием GppNHp и NaF в чувствительности к трипсину и по другим непрямым
критериям заключали, что эти виды активации связаны с различными белками
[8, 64]. Однако поздние многочисленные работы [6, 7, 24, 125- 127]
свидетельствовали о том, что действие фторида направлено именно на TV-
белок. Это мнение получило окончательное подтверждение в результате
экспериментов по реконструкции, где использовались мембранные препараты
TV-белка, лишенные каталитического белка [125, 126], или высокогомогенные
препараты TV-белка, яолученные из холатных экстрактов [14, 15]. Кроме
того, было показано, что фторидная стимуляция не определяется рецептором,
так как она имеет место в клетках UN С, в которых нарушено сопряжение
рецептора с TV-белком [50]. По данным реконструкции каталитический белок
также имеет значение для фторидной стимуляции [8, 111].
В последнее время обсуждается роль Mg2+ в активации аденилатциклазы.
Действие Mg2+ направлено как на рецептор (перевод рецептора в состояние
высокого сродства к агонистам), так и на каталитический белок (увеличение
максимальной скорости аденилатциклазной реакции). Для осуществления
действия Mg2+ абсолютным требованием является наличие в аденилатциклазной
системе TV-белка [50, 65, 111, 128].
Отсюда следует, что на TV-белке должен быть расположен участок
связывания свободного Mg2+. И в самом деле, в лаборатории Бирнбаумера
[113, 118] показана регулирующая роль ионов Mg2+, которые ускоряли
процесс активации фракции TV-белка гуа-ниловыми нуклеотидами и фторидом.
Известно также, что удаление Mg2+ из мембран с помощью высоких
концентраций ЭДТА вызывает высвобождение связанных гуаниловых нуклеотидов
и предотвращает активацию аденилатциклазы под действием GppNHp [104,
129]. Участок связывания двухвалентных катионов изучался и на
высокогомогенном TV-белке [33]. При этом было показано, что Mg2+
абсолютно необходим для поддержания активированного состояния TV-белка.
Авторы полагают, что двухвалентные катионы могут регулировать медленную
диссоциацию субъединиц TV-белка. В этой работе показано также, что
процессы активации - инактивации чувствительны также к Мп2+, Са2+, Ва2+ и
Sr2+, т. е. что участок связывания двухвалентных металлов не имеет
абсолютной специфичности к катионам. Однако одновалентные катионы Na+,
К+, NH4+эффекта не вызывали.
109
Механизм активации /V-белка и строение центра связывания
гуаниловых нуклеотидов
Термин "активация N-белка" стал упоминаться в литературе с развитием
работ по кинетике реконструкции фракций, содержа щих отдельно N-белок и
каталитический белок [10, 14, 15, 88, 113, 118, 125, 126, 130]. Его
следует понимать как изменения N-белка, необходимые для перевода
каталитического белка аденилатциклазы в высокоактивное состояние.
Молекулярные события, приводящие к активации N-белка, связаны в
первую очередь с функционированием ГТФ-связываю-щего центра,
расположенного на субъединице 42 000 или 52 000 дальтон.
В исследованиях, проводимых на аденилатциклазе, почти не изученными
являются два вопроса: каково строение центра связывания гуаниловых
нуклеотидов и какие особенности химической структуры нуклеотидов являются
необходимыми и достаточными для активации?
Разрешение этих вопросов позволило бы с помощью аналогов нуклеотидов
направленно изменять регуляторные свойства N-бел-ка. До сих пор изучение
характеристик топографии регуляторного центра проводилось в основном лишь
косвенными методами.
Тем не менее некоторые заключения на основании имеющихся данных
сделать можно. Так, Шпигель с сотр. [7] показали, что ГТФ-агароза не
обладает сродством к ГТФ-связывающим белкам аденилатциклазного комплекса
в том случае, если ГТФ "пришит" через рибозу, но является хорошим
аффинным сорбентом, если ГТФ "пришит" через у'Ф0СФат- Эти данные
свидетельствуют о значительном вкладе кольца рибозы в сродство нуклеотида
к регуляторному участку. И в то же время небольшие изменения в рибозной
части молекулы З'-дезокси-ГТФ не мешают активации аденилатциклазы и даже
усиливают ее [131]. Интересно, что активирующие свойства ГТФ сохраняются
и в некоторых случаях усиливаются при таких модификациях "у-фосфата,
которые не затрагивают гидроксильной группы. К таким соединениям
относятся р-фенилендиамин-ГТФ [7], гуанозин-5'-тетрафосфат [132], ГТФуЭ
[33, 116], Р3-(4-азидоанилид)Р1-ГТФ и Р3-(Ы-(аминоэтил)-1-наф-тиламин-8-
сульфонат)Р*-ГТФ [133]. В то же время прямое изучение ГТФ-связывающего
центра гомогенного N-белка показало, что сродство к нему нуклеотидов
уменьшается в ряду ГТФ>ГДФ> >ГМФ, т. е. число зарядов в фосфатном участке
