Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
и взаимодействие его с Л'-белком
TV-бёлок образует более или менее прочные комплексы с каталитической
субъединицей. Об этом свидетельствуют накопленные к настоящему времени
многочисленные данные, в том числе и весьма противоречивые сведения о
молекулярных размерах каталитического белка аденилатциклазы.
Каталитический белок отдельно от TV-белка по принятой многими ведущими
исследователями концепции нестабилен и может использовать только
нефизиологический субстрат Мп2+-АТФ. Мд2+-АТФ-зависимая активность у
эукариотической аденилатциклазы присуща функциональному комплексу C=N [8,
22, 41, 42].
Показано, что Мп2+-АТФ является физиологическим субстратом лишь для
аденилатциклаз низших эукариот и прокариот [43- 45], а также для
цитоплазматической аденилатциклазы семенников, не чувствительной к
гуаниловым нуклеотидам и представляющей собой, по всей видимости,
индивидуальный каталитический белок [46, 47]. При солюбилизации
плазматических мембран некоторых эукариотических клеток увеличивается
способность солюбилизированного фермента к использованию Мп2+ и
уменьшается чувствительность к регуляции гуаниловыми нуклеотидами [22,
41, 42, 48]. В интактных мембранах большие концентрации Мп2+ могут
приводить к нарушению сопряжения компонентов аденилатциклазного
комплекса, т. е. к снижению гормональной стимуляции и ослаблению эффектов
гуаниловых нуклеотидов [49, 50].
2 Знаками R, С н N обозначены рецепторный, каталитический и
регуляторный белки аденилатциклазного комплекса соответственно.
98
Б комплексе с регуляторным белком каталитический белок обнаруживается
практически во всех экстрактах тканей, если для экстракции используют
неионные детергенты типа луброл или тритон или дигитонин при низкой
ионной силе [14]. О существовании связи каталитического белка с N-белком
в экстрактах свидетельствуют и наличне регуляции фторидом и гуаниловыми
нуклеотидами, и низкая величина отношения активности, измеряемой в
присутствии Мп2+, к активности, измеряемой в присутствии Mg2+. Даже в том
случае, когда Нир с сотр. разделяли аденил-атциклазу на две фракции, одна
из которых не была чувствительна к гуаниловым нуклеотидам, эта фракция не
обладала свойствами собственно каталитического компонента и, как
предполагают авторы, представляла собой слабодиссоциирующий комплекс
каталитического белка с N-белкои [51].
Равновесие C+N+&N-С в экстрактах, по-видимому, настолько сдвинуто
вправо [52], что возникает серьезная проблема полного разделения С и N.
Она осложняется тем, что каталитический белок, взятый отдельно, весьма
нестабилен при очистке. Методами гель-фильтрации [51], аффинной
хромотографии Л'-белка [6] или -аденилатциклазы, имеющей сродство к
кальмодулину [53, 54], удается добиться лишь частичного разделения Л/-
белка и каталитического белка.
Определенные перспективы открылись при использовании хо-лата натрия в
сочетании с высокой ионной силой, создаваемой сульфатом аммония. Росс [9]
показал, что в этих условиях сульфат аммония вызывает диссоциацию
комплекса С-N и аггрега-цию каталитического белка и предотвращает
инактивацию каталитической субъединицы. Таким же образом разделили Л/-
белок и каталитический белок мозга Штриттматтер и Нир [10]. Лондос -с
сотрудниками, использовавшие для солюбилизации каталитического белка
дезоксихолат натрия и меньшую ионную силу, получили в 20 раз более низкий
выход активности по сравнению с результатами, полученными Россом [41].
Битонти с сотр. [55] недавно сообщили, что цвиттерионное производное
холата также .дает хорошее разделение TV-белка и каталитического белка в
отсутствие сульфата аммония, что позволяет повысить стабильность
получаемых компонентов.
О реальном существовании комплекса С-N не только в экстрактах, но
также в мембранах свидетельствует меньшая величина 'молекулярной массы
аденилатциклазной мишени, определяемая в присутствии Мп2+ и в отсутствие
других эффекторов аденилатциклазной системы, по сравнению с величиной,
определяемой в присутствии Mg2+ [39].
По-видимому, состояние равновесия C+N^N-С отражается на определяемой
величине молекулярной массы аденилатциклазы [51, 56, 57]. В тех случаях,
когда N-белок не отделяли от каталитического, измеряемая молекулярная
масса аденилатциклазы в экстрактах варьировала от 159 000 дальтон в
почках крыс [21], 170 000 в почках морских свинок [58] и 119 000 дальтон
в щито-
4*
99
видной железе быка [59] до 220 000 и 199 000, 265 000 дальтон в мозговой
ткани [18, 51]. После активации аденилатциклазы под действием гуанилил-
б'-имидодифосфата (GppNHp) или фторида определяемая молекулярная масса не
изменялась сколько-нибудь существенно, она составляла в клетках лимфомы
549 220 000 дальтон [4], в печени крыс - 183-220000 дальтон [60]. К
сожалению, в тех случаях, когда каталитический белок не удавалось
полностью отделить от TV-белка, гидродинамический анализ размеров
каталитического белка не проводился. Наименьшие величины его молекулярной
