Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
отличается от активности иммобилизованных тетрамеров этих ферментов.
Получение иммобилизованных мономеров
naiaaf дегидрогеназы
Показанная выше возможность выделения активных мономеров глицеральдегид-
3-фосфатдегидрогеназ свидетельствовала, что для осуществления
каталитического акта этим ферментом четвертичная структура не является
обязательной. В то же время в литературе существовали данные, что для
лактатдегидрогеназы, у которой в значительно меньшей степени выражены
кооперативные взаимодействия между субъединицами, объединение по крайней
мере двух субъединиц необходимо для протекания ферментативной реакции [8]
или для ее значительного ускорения [6, 7].
Для выяснения причин имеющихся противоречий нами было проведено
выделение мономеров лактатдегидрогеназы по разработанному для
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы методу и сравнение свойств
полученных мономеров со свойствами тетрамеров [И]. Оптимальными условиями
для получения мономеров лактатдегидрогеназы является инкубация исходного
препарата тетрамера в присутствии 4,6 М мочевины в течение 120-150 мин;
75%-ная инактивация фермента происходит через 70^100 минут инкубации,
затем активность препарата остается неизменной в течение 50 мин, а
содержание белка снижается до значений, характерных для мономерной формы.
Таким образом, так же как для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, в
ходе инактивации наблюдается плато, причем отобранные в конце этого плато
пре-
87
параты содержат иммобилизованные мономеры. Время, необходимое для
достижения плато, зависит от характеристик исходного препарата
иммобилизованных тетрамеров: чем дольше до начала эксперимента хранились
растворимый препарат дегидрогеназы или иммобилизованные тетрамеры, тем
быстрее протекал процесс инактивации. Однако во всех случаях наблюдалось
плато на кривой инактивации. Полученные иммобилизованные мономеры
обладали способностью к реассоциации с субъединицами из раствора и
удельной активностью, практически не отличающейся от активности
иммобилизованных тетрамеров. Таким образом, для появления каталитической
активности нет необходимости в объединении субъединиц в олигомер.
Причиной низкой или нулевой активности мономеров лактатдегидрогеназы в
других работах, по нашему мнению, может быть неспособность
денатурированных субъединиц к восстановлению третичной структуры после
удаления мочевины или крайняя медленность этого процесса. Возможно,
восстановление структуры начинается только после добавления извне
растворимых субъединиц, т. е. в ходе реассоциации. Вероятно, для
полноценного сворачивания полипептидных цепей необходимо их
взаимодействие. При получении мономеров по предложенной нами методике
третичная структура связанных с матрицей мономеров не изменяется и,
следовательно, стадия ренатурации может быть исключена.
В таблице 3 суммированы имеющиеся к настоящему времени сведения о
каталитической активности мономерных форм дегидрогеназ. Из таблицы
следует, что в большинстве случаев мономерные иммобилизованные формы
дегидрогеназ обладают способно-
Таблица 3-
Каталитическая активность мономерных иммобилизованных форм НАД-
зависимых дегидрогеназ
Фермент Исходная Активность Способ получения
Активность Ссылка
степень иммобили мономера после
ре-
олигомер зованного
ассоциа
ности мономера, ции, %
%
Лактатдегидрогеназа тетрамер 14---23 контролируемая 62---
75 [П]
денатурация
Г лицера ль Деги ддегидроге- тетрамер 20---25 то же 84---
88 [15, 16]
наза из дрожжей 22---27 65---
70
Глицеральдегиддегидроге- тетрамер то же
наза из мышц кролика
119]
Малатдегидрогеназа димер 77 диссоциация 94
при pH 5,0
Алкогольдегидрогеназа днмер 2---8 полная денату 43
[20]
рация
Лактатдегидрогеназа тетрамер 10---16? полная денату 108---
114 [6, 7]
рация
То же димер отсутст то же 58
[8]
вует
88
-стью к катализу в отсутствие межсубъединичных контактов. Причины
возможной инактивации мономеров лактатдегидрогена-зы в работах [6-8] были
