Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
матрицей субъединицы. Результаты опытов по инактивации иммобилизованных
на сефарозе через одну субъединицу тетрамеров глицеральдегид-3-
фосфатдегидроге-
назы из дрожжей приведены на рис. 2.
Из приведенных данных следует, что в начальный период инкубации в 8 М
мочевине происходит быстрая 50%-ная инактивация, а затем этот процесс
замедляется. После снижения активности до 25% от исходной инактивация
прекращается и в течение
2 ч активность препарата остается неизменной. Определение содержания
белка в препарате на разных стадиях инкубации показывает, что 50%-ное
снижение активности сопровождается двукратным снижением количества белка,
т. е. с наибольшей скоростью инактивируется несвязанный непосредственно с
носителем
Рис. 2. Зависимость активности и содержания белка в иммобилизованных
тетрамерах глицеральде-гид - 3 - фосфатдегидрогеназьг из дрожжей. Фермент
инкубировали в 8 М мочевине, приготовленной на 0,1 М фосфате натрия (pH
7,6, 5 мМ ЭДТА и 2 мМ дитиотре-итол), при температуре 28°С
85
димер дегидрогеназы. Более медленно инактивируется субъединица,
ассоциированная с ковалентно иммобилизованным на носителе мономером
(снижение активности до 25% от исходной), причем в течение 60-80 мин
инкубации эта субъединица остается в связанном с носителем состоянии, так
как содержание белка на носителе не изменяется. Через 140-180 мин
инкубации полностью сохраняет свою активность ковалентно связанный с
матрицей мономер дегидрогеназы. Следует отметить, что выделенный
иммобилизованный мономер, вновь подвергнутый обработке мочевиной,
довольно быстро (за 10 мин) полностью теряет свою активность. Вероятно,
сохранение активности мономера в течение 3 ч инкубации обусловлено тем,
что в составе тетрамера и димера связанные с ним уже неактивные
субъединицы защищают мономер от денатурации. Снижение содержания белка на
носителе до 75% от исходного происходит только через 140-180 мин
инкубации, т. е. в период сохранения 25%-ной активности от исходной
происходит постепенное удаление неактивной субъединицы из состава димера.
Если через 140-160 мин инкубации в мочевине отмыть препарат дегидрогеназы
от денатурированного белка, то можно получить мономеры, связанные
ковалентно с матрицей и полностью сохранившие свою активность.
Предложенный подход был апробирован нами при получении мономеров
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.
Дегидрогеназа из этого источника значительно менее устойчива к действию
денатурирующих агентов, чем фермент из дрожжей, поэтому для получения
мономеров мы использовали инкубацию при более низкой концентрации
мочевины: (4,0 М).
При инкубации препарата иммобилизованного фермента наблюдалась
ситуация, аналогичная описанной выше для фермента из дрожжей. Подбор
условий для получения мономеров заклю-
Таблица 2.
Реактивация иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназы с денатурированными субъединицами из раствора
Содержание белка
Удельная
Тип препарата дегидрогеназы мкг/мл %
1. Иммобилизованные тетрамеры дегидрогеназы из 230±5 100
100
2. Иммобилизованные мономеры.......... 62±2 27
26
3. Реконструированные тетрамеры (после реассоциа 202±4 '88
84
ции с денатурированными субъединицами) ....
1. Иммобилизованные тетрамеры из мышц кролика . 127+4 100
100
2. Иммобилизованные мономеры.......... 35±2 27
26,5
3. Реконструированные тетрамеры......... 109±4 86
67
86
чается лишь в варьировании концентраций мочевины и в выборе такой
концентрации, при которой наблюдается плато после снижения активности на
75% от исходной. В начале этого плато в препарате содержится димер,
состоящий из одной активной и связанной ковалентно с матрицей субъединицы
и ассоциированной с ней неактивной субъединицы, а в конце плато - только
активная иммобилизованная субъединица. Для того чтобы инактивированная
субъединица успела перейти в раствор, продолжительность плато должна быть
не менее 30 мин.
Препараты иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-
фосфатдегидрогеназы из обоих источников были способны к реассоциации с
субъединицами гомологичных ферментов из раствора (табл. 2). Для
реассоциации использовали предварительно денатурированные в мочевине
субъединицы дегидрогеназ, которые трижды в 8-кратном избытке добавляли к
препаратам мономеров.
Увеличение содержания связанного с носителем белка свидетельствует об
образовании в ходе реассоциации тетрамерных форм, однако в случае
фермента из мышц не удалось добиться полного восстановления их
активности.
Удельная активность иммобилизованных мономеров глицераль-дегид-3-
фосфатдегидрогеназы из дрожжей и скелетных мышц кролика практически не
