Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
четвертичной структуры. Нативная молекула НАД-зависимых дегидрогеназ
состоит из нескольких (от двух до восьми) идентичных субъединиц, причем
каждая из них формирует свой собственный активный центр. При исследовании
таких ферментов.возникает естественный вопрос - зачем же нужна
олигомерная структура, если активный центр образуется без ее участия?
Одна из функций четвертичной структуры - стабилизация белковой глобулы за
счет образования общего гидрофобного яд* ра - была известна достаточно
давно и не вызывала сомнений (например [1]). В отношении же роли
ассоциации субъединиц в катализе и регуляции ферментативной активности
долгое время сохранялись весьма неопределенные представления. С одной
стороны, в каждой субъединице олигомера дегидрогеназ были все предпосылки
для осуществления каталитического акта, а с другой - при проведении
опытов в растворе накапливалось все большее количество данных об
отсутствии активности у мономерных форм и о необходимости их ассоциации
для появления активной молекулы фермента [2, 3]. Эти данные, а также факт
существования кооперативных взаимодействий между субъединицами (что
характерно для большинства дегидрогеназ) позволили ряду исследователей
предложить следующую концепцию: катализ возможен только при объединении
нескольких субъединиц, поскольку для полного протекания реакции в
активном центре одной субъединицы необходимы определенные изменения в
сопряженном с ним активном центре другой субъединицы. Например, в случае
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.2.1.12) фосфоролиз
ацилфермента с образованием продукта реакции (а возможно, и отщепление
НАДН) в активном центре одной субъединицы происходит только при
связывании субстрата в соседней субъединице
[4]. Сущность описанного механизма (получившего название "флип-флоп")
заключается как бы во взаимопомощи двух активных центров, способствующей
протеканию ферментативной реакции.
Не отрицая важности такого механизма реакции в условиях, близких к
естественным (ненасыщающие концентрации кофакто-
80
ров и субстратов), мы полагали, однако, что взаимодействия субъединиц в
катализе должны иметь минимальное значение при определении активности
олигомерных ферментов в обычных экспериментальных условиях - при избытке
кофакторов и субстратов, кратковременном измерении активности (до начала
ингибирования реакции ее продуктами). В этом случае активностью могли
обладать не только олигомерные, но и мономерные формы дегидрогеназ.
Причиной же инактивации ферментов-олигомеров при их диссоциации в
растворе мог быть не распад на субъединицы, а быстрая денатурация
мономеров, обусловленная их нестабильностью в отсутствие контактов с
соседними полипептидными цепями. К сожалению, многочисленные эксперименты
по денатурации и реактивации различных НАД-зависимых дегидрогеназ,
проведенные в растворе, не давали однозначного ответа на вопрос о пер-
сопричине потери мономерами ферментативной активности [2, 3,. 5]. Факты
инактивации мономеров при диссоциации исходных форм дегидрогеназ не
вызывают сомнений, но установить на основании только кинетических данных,
чем вызвана инактивация - собственно распадом на субъединицы или
конформационными изменениями последних - на наш взгляд, практически
невозможно.
Для исследования вопроса о каталитической активности мономерных форм
НАД-зависимых дегидрогеназ мы прибегли к методу иммобилизации олигомеров
этих ферментов на нерастворимом носителе - в нашем случае сефарозе 4В.
Иммобилизация должна была бы предотвратить реассоциацию мономеров
дегидрогеназ, а также, по нашим предположениям, оказать на мономеры
стабилизирующее действие и, следовательно, помешать их инактивации. До
начала нашей работы в литературе имелись противоречивые сведения о
свойствах иммобилизованных мономеров одной из НАД-зависимых дегидрогеназ
- лактатдегидрогеназы. В одной работе были получены иммобилизованные
ковалентно на пористом стекле мономеры лактатдегидрогеназы, обладающие
довольно низкой удельной активностью [6, 7], а в другой - полностью
неактивные мономеры [8]. Мы изучали каталитические свойства
иммобилизованных мономеров глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из двух
различных источников, а также мономеров лактатдегидрогеназы (КФ
1.1.1.27).
Особенности иммобилизации олигомерных ферментов, используемых
для получения связанных с матрицей субъединиц
Препараты иммобилизованных ферментов-олигомеров, которые используются для
получения ковалентно связанных с матрицей мономерных форм, должны
удовлетворять некоторым требованиям. Во-первых, олигомерная молекула
белка должна быть связана с носителем только через одну из субъединиц,
так как в противном случае невозможно будет получить иммобилизованные
моно-
81
Таблица 1
Зависимость количества связанного с сефарозой фермента
и его активности от степени активации носителя бромцианом
мерные формы. Во-вторых, необходимо иметь точную информацию о том, из
