Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
скольких субъединиц состоит иммобилизованный олигомер. Без таких сведений
трудно интерпретировать данные по диссоциации: например, снижение
содержания белка на матрице в 2 раза может быть следствием диссоциации
тетрамера на димеры или димера на мономеры.
Приведенные в табл. 1 данные показывают, как зависит характер
присоединения тетрамерной молекулы глицеральдегид-3-<фосфатдегидрогеназы
к сефарозе 4В от количества добавленного для активации носителя
бромциана. Для определения числа субъединиц фермента, вовлеченных в
ковалентное связывание с носителем, мы использовали жесткую обработку
препаратов дегидрогеназы 8М мочевиной в течение 3-16 ч [9]. Из данных
таблицы видно, что с увеличением степени активации возрастает число
субъединиц, ковалентно связанных с матрицей, и одновременно снижается
удельная активность фермента. При концентрациях
BrCN ниже 10 мг/мл уплотненного центрифугированием геля сефарозы фермент
связывается только через одну из субъединиц. В опытах с гли-цер альдегид-
3-фосфатдегидро-геназой из разных источников и с лактатдегидрогеназой мы
использовали степень активации носителя, соответствующую добавлению 5 мг
BrCN на 1 г влажного геля сефарозы или 3 мг на 1 мл уплотненного геля. Ни
в одном из многочисленных экспериментов не наблюдалось связывания
ферментов более чем через одну из субъединиц. Следует отметить, что
количество связывающихся с носителем субъединиц зависит не только от
количества добавленного для активации BrCN, но и от присутствия в среде
для иммобилизации различных компонентов буфера. Так, при введении
2-меркаптоэтанола в концентрации 4 мМ иммобилизация глице-ральдегид-3-
фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц осуществляется только через одну
субъединицу даже при добавлении 20 мг BrCN на 1 мл уплотненного геля
сефарозы [9, 10].
Описанные выше опыты свидетельствуют также, что иммобилизации на
матрице в указанных условиях подвергается именно тетрамерная форма
фермента, поскольку при низких степенях активации носителя содержание
белка на матрице после обработ-
Дегидрогеназа Количество BrCN, Количество белка иа Активность
дегидро Количество белка на
добавленного иа 1 мл сефарозе, мкг/мл геля геназы, ед/мг
белка сефарозе после обра
геля, мг
ботки В М мочевины,
мкг/мл геля
Из скелетных 4 60 54
14
ыышц крысы 10 90 45
30
20 160 30
65
50 340 16
240
100 430 14
320
200 430 14
320
Из дрожжей 5 130 57
32
30 320 26
---
100 470 15
---
150 500 15
---
82
ки мочевиной снижается в 4 раза. Из опытов с растворимыми
глицеральдегид-3-фосфатдегирогеназами известно, что степень-олигомерности
этого фермента никогда не превышает четырех, а диссоциация на димеры
тетрамера дегидрогеназы начинается при концентрациях ниже 0,200 мг белка
в 1 мл или в специфических условиях, вызывающих такую диссоциацию.
Более сложная ситуация наблюдалась нами с лататдегидро-геназой из
скелетных мышц свиньи при ее иммобилизации на активированной BrCN
сефарозе [11]. При иммобилизации лактат-дегидрогеназы на сефарозе Чан с
соавт. обнаружили, что с матрицей связывается димерная форма фермента
[8]. Аналогичные результаты были получены в нашей работе при
иммобилизации препаратов лактатдегидрогеназы, хранившихся в течение года
[11]. Непосредственно после иммобилизации с матрицей связывается
тетрамерная форма фермента, но 16-часовая инкубация препарата при 4° С
приводит к его диссоциации на димеры. Диссоциация "свежего" препарата
лактатдегидрогеназы, иммобилизованного на сефарозе, происходит в
незначительной степени [11]. В принципе оба препарата (иммобилизованные
димеры и иммобилизованные тетрамеры) могут быть использованы для
получения связанных с матрицей мономеров, но обязательным предварительным
условием эксперимента является проведение опытов, позволяющих однозначно
судить об исходной степени олигомер* ности иммобилизованных форм.
Получение иммобилизованных мономеров
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназ
