Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Для получения связанных с матрицей мономерных форм ферментов используют,
как правило, прием, предложенный Чаном в 1970 г. [12]. Метод заключается
в обработке олигомерных белков, ковалентно иммобилизованных через одну из
субъединиц, в жестких условиях, приводящих к полной денатурации всех
субъединиц и разворачиванию всех полипептидных цепей. Несвязанные с
матрицей ковалентной связью полипептидные цепи переходят в раствор, а
последующее удаление денатурирующего агента должно приводить к
постепенной ренатурации иммобилизованной субъединицы. Основным
недостатком метода является наличие .стадий денатурации и ренатурации
иммобилизованного мономера, поскольку последний процесс никогда не
протекает со 100%-ной эффективностью. С помощью описанного подхода
авторам, предложившим его, удалось получить активные мономеры альдолазы и
трансальдолазы, однако удельная активность изолированных мономеров была
значительно ниже, чем исходных олигомерных форм [13, 14]. В большинстве
же случаев активность выделенных таким способом мономеров ферментов
полностью отсутствовала или была крайне низкой. Следует также отметить,
что выделение мономерных форм с низкой удельной активностью практически
не позволяет прийти ни к какому конкретному выводу о роли
83
четвертичной структуры в осуществлении катализа. Дело в том, что низкая
удельная активность \мономерных форм может объясняться по крайней мере
тремя разными причинами. Во-первых, распад олигомера на субъединицы может
приводить к уменьшению активности последних за счет разрыва
межсубъединичных контактов, необходимых для эффективного протекания
ферментативной реакции (и только эта ситуация могла бы представлять
интерес с точки зрения понимания смысла олигомерного строения ферментов).
Во-вторых, при получении иммобилизованных мономеров никогда нельзя
полностью исключить возможность присутствия в препарате некоторого
количества олигомерных форм, а также взаимодействия части
иммобилизованных субъединиц друг с другом непосредственно на матрице. По
этим причинам препарат иммобилизованных субъединиц, на самом деле
полностью неактивных, может иметь незначительную способность к катализу.
Третьей и, на наш взгляд, наиболее частой причиной снижения удельной
активности мономерных форм может быть неполное восстановление их
ферментативной активности в процессе ренатура-ции субъединиц.
Нами были проведены эксперименты по получению мономеров
иммобилизованной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из дрожжей по
методу Чана. Оказалось, что в условиях, приводящих к полной денатурации
субъединиц, полученные мономеры не обладали каталитической активностью.
Добавление к используемому для денатурации раствору 8 М мочевины
кофактора, дити-отреитола или 2-меркаптоэтанола, оказывающих на фермент
стабилизирующее действие, а также введение этих соединений на стадии
ренатурации не приводит к получению активных мономеров [15, 16].
Кроме метода Чана существовал еще один подход, позволивший многим
исследователям получить активные иммобилизованные формы с меньшей
степенью олигомерности, чем исходный нативный фермент. Метод заключается
в использовании специфических условий диссоциации, как правило, известных
, из опытов в растворе и достаточно мягких. В большинстве экспериментов в
таких специфических условиях происходит распад иммобилизованного
олигомера на активные субъединицы или на активные агрегаты субъединиц
(например, димеры в случае глицеральде-гид-3-фосфатдегидрогеназы). Однако
такой подход не всегда позволяет получить иммобилизованные мономерные
формы. Так, для глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы доказаны очень
высокая прочность связи между мономерами, которые образуют так называемый
"функциональный димер", и отсутствие в неденатурирующих условиях процесса
распада фермента на отдельные субъединицы [17, 18]. По этой причине для
дегидрогеназы не удается подобрать условия, специфически вызывающие
диссоциацию фермента на активные субъединицы.
В наших работах был предложен новый методический прием, позволяющий
получать активные субъединицы олигомерных фер-
84
ментов в денатурирующих условиях (например, при высоких концентрациях
мочевины). Предложенный метод иллюстрирует рис. 1. Сущность метода
заключается в подборе таких условий денатурации, в которых происходят
инактивация и переход в раствори* мое состояние всех субъединиц, кроме
связанных с матрицей ковалентно. Важно отметить, что последние не
подвергаются де-
Рис. 1. Схема получения препаратов иммобилизованных мономеров в
условиях, вызывающих денатурацию всех субъединиц фермента, за исключением
субъединицы, связанной с матрицей ковалентно.
1 - каталитически активная конформация субъединиц, 2 - неактивная
конформация, 3 - полностью денатурированные субъединицы
натурации и полностью сохраняют свою активность на всех стадиях
обработки. Основной предпосылкой при разработке метода служили наблюдения
о стабилизирующем действии иммобилизации на ковалентно связанные с
