Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [4] и аффинной
хроматографии
[5]. Регуляторный белок, обозначаемый разными исследователями как G-
белок, G, N, G/F. или белок, связывающий гуаниловые нуклеотиды,
достаточно полно отделили от каталитического, используя свойство N-белка
связываться с ГТФ-агарозой. После
*4
элюции Л'-белка с аффинной матрицы гуаниловыми нуклеотидами его можно
было вновь реконструировать с каталитическим белком [6, 7]. Росс с сотр.,
используя различия в чувствительности регуляторного и каталитического
компонентов к нагреванию и к обработке N-этилмалеимидом, выборочно
инактивировали каталитический белок в экстрактах плазматических мембран
различных клеток. Полученные таким образом препараты N-белка затем
использовали для встраивания в мембраны сус~-клетоки это приводило к
восстановлению регуляторных свойств аденилатциклазьг
[8]. Полное разделение N-белка и каталитического белка с сохранением их
активностей достигнуто гель-хроматографией натрий-холатных экстрактов
мембран печени и мозга в растворах высокой ионной силы [9, 10].
p-рецептор ретикулоцитов крыс, связанный с меченым антагонистом,
также отделяли гель-фильтрацией OTN-белка, моченного J2P в катализируемой
холерным токсином реакции АДФ-рибозилиро-вания [12]. И наконец, из печени
кролика [13, 14] и эритроцитов-индюка [15] в лаборатории Джилмана в
высокоочищенном виде получены препараты N-белка, свободные от примесей
рецепторов или каталитического белка.
Все составные части аденилатциклазного комплекса являются
интегральными белками мембран. Они имеют на своей поверхности гидрофобные
участки, о чем свидетельствует связывание этих; белков с неионными
детергентами. В результате гидродинамических исследований детергентных
экстрактов мембран было показано, что TV-белок имеет сравнительно
небольшую гидрофобную-зону, так как ои связывает меньшее количество
детергента [16, 17] , чем каталитический [4, 18] или рецепторный белок
[4]. В эритроцитах человека N-белок обнаруживается на внутренней
поверхности плазматической мембраны [19], однако какая-то часть его все
же связана с липидным бислоем, так как селективные агенты, высвобождающие
из мембран неинтегральные белки,, не способны полностью солюбилизировать
TV-белок [16, 20]. Каслов с сотр. предполагают, что N-белок имеет
вытянутую форму" и пронизывает мембрану таким образом, что его
гидрофобный участок связывается с липидным бислоем, тогда как
гидрофильная часть экспонирована в цитоплазму [16]. О прочной связи с
бислоем каталитического и рецепторного белков может свидетельствовать тот
факт, что хорошая реконструкция стимулируемой катехоламинами
аденилатциклазной активности происходит только в тех случаях, когда в
солюбилизированном виде находится N-белок, а каталитический белок и
рецептор встроены в мембрану [8].
Следует отметить, что, в отличие от гидрофобного каталити-
1 Клетки сус~ - генетический вариант клеток мышиной лимфомы S49,
содержащий в мембранах нормальный Р рецептор н каталитический белок
адеиил-атциклазы, лишенный чувствительности к гормонам и к гуаниловым
нуклеотидам. Эти клетки не содержат белковых субстратов для
катализируемого холерным токсином АДФ-рибозилирования [II].
9?
ческого белка, обнаруживаемого в мозге быка и в клетках лим-фомы 549 [4,
18], каталитический белок из мембран почек и семенников крыс почти не
связывает детергента [21, 22]. Кроме того, в семенниках крыс и в сперме
быка обнаружена цитоплазматическая форма аденилатциклазы [22, 23].
Возможно, что эти различающиеся по гидрофобности и молекулярным размерам
формы фермента являются продуктами разных генов или же результатом
протеолиза или дифференциальной солюбилизации различных субъединиц
аденилатциклазы.
Для определения молекулярных размеров белков аденилатци-клазной
системы используют в основном два метода: гидродинамический анализ
детергентных экстрактов мембран и метод молекулярных мишеней, который
дает возможность изучать нативную структуру комплекса в мембране.
Молекулярная масса и субъединичная
структура А -белка
В настоящее время наиболее подробно охарактеризованы молекулярная масса
регуляторного N-белка. Данные, полученные с использованием трех методов
идентификации N-белка, дают похожие результаты. Так, Пфейффер с помощью
[3Н] Р3-(4-азидо-анилид) Р'-ГТФ при блокировании мембранных белков
эритроцитов голубя показал включение метки в полипептиды с молекулярной
массой 86 000, 53 000, 42 000 и 23 000 дальтон [6]. Из них только
полипептид с молекулярной массой 42 000 дальтон был •связан с
аденилатциклазной активностью в детергентном экстракте при
центрифугировании в градиенте плотности сахарозы. Этот полипептид,
проявляющий биологическую активность регуляторного белка в экспериментах
по реконструкции, можно было отделить от аденилатциклазы на аффинном
