Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
разобраны нами выше. Получение практически неактивных мономеров
алкогольдегидрогеназы, вероятно, также обусловлено их денатурацией при
обработке в жестких условиях, причем восстановления активности не
наблюдается даже после реассоциации с субъединицами из раствора.
Возможно, что применение иных условий обработки позволит и в этом случае
получить полностью активные субъединицы.
Функциональное значение объединения
субъединиц НАД-зависимых дегидрогеназ
В настоящее время существует довольно ограниченная информация в
отношении вынесенной в заголовок этого раздела проблемы. Наиболее
очевидной и довольно давно доказанной функцией такого объединения
является стабилизация субъединиц в составе олигомера. Поскольку в
литературе долгое время главенствовали представления об отсутствии
каталитической активности у мономерных форм дегидрогеназ, считалось
очевидным также первостепенное значение объединения субъединиц для
осуществления катализа и регуляции активности НАД-зависимых дегидрогеназ.
В наших работах с иммобилизованными димерными формами глицеральдегид-
3-фосфатдегидрогеназ из различных источников было установлено, что для
проявления большинства кооперативных взаимодействий между субъединицами
достаточно объединения двух субъединиц [21, 22]. Таким образом,
осуществление катализа и регуляции возможно уже на уровне димерной формы.
Мы обнаружили также, что иммобилизованные даже через одну субъединицу
димеры обладают значительно большей стабильностью, чем димеры в растворе.
Можно предположить, что in vivo такая стабилизация димеров, находящихся в
равновесии с тетрамерами, осуществляется за счет их взаимодействия с
функционально связанными ферментами или структурными белками, т. е.
функционирующей формой фермента в клетке может являться не тетрамер, а
стабилизированный димер.
Оставалось, однако, непонятным функциональное значение объединения
двух субъединиц в димер. Дело в том, что, по мнению большинства
исследователей, кооперативные взаимодействия между субъединицами
глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы играют первостепенное значение в
осуществлении каталитического акта, точнее в регуляции последовательного
протекания различных его стадий на двух активных центрах "функционального
димера" [23]. Эта концепция хорошо согласуется с предположением об
отсутствии каталитической активности у отдельных субъединиц дегидрогеназ
(эксперименты по диссоциации и инактивации дегидрогеназ в растворе [2]).
Так как в наших работах было доказано, что мономерные формы
глицеральдегид-3-фосфатдегид-рогеназы столь же эффективно катализируют
реакцию, как и
89
тетрамеры, то роль объединения субъединиц и существование кооперативных
взаимодействий между ними становились непонятными. Нами было высказано
предположение, что различия между каталитической эффективностью
иммобилизованных мономеров и тетрамеров нивелируются при определении их
активности в искусственных условиях при концентрациях субстратов, близких
к насыщающим. При недостатке какого-либо из субстратов или кофакторов эти
различия могут быть более выражены. Наиболее вероятно, что именно
изменение концентрации кофактора, для связывания которого характерна
кооперативность, должно играть решающую роль в изменении каталитических
свойств иммобилизованных мономеров и тетрамеров. Для глицеральдегид-3-
фосфат-дегидрогеназы из дрожжей нам не удалось обнаружить различий между
иммобилизованными мономерами и тетрамерами в величинах Vmax и Кт Для 3-
фосфоглицеринового альдегида и НАД. Значения этих параметров были
равны соответственно
50 мкмоль/мин на 1 мг белка, 0,20±0,2 мМ и 0,05±0,01 мМ. Од-
нако такое определение активности не позволяет выяснить, как ведет себя
фермент при очень низких концентрациях кофактора, поскольку в
используемой системе последний не подвергается регенерации. Применив для
регенерации кофактора систему, содержавшую лактатдегидрогеназу, пируват и
НАДН, нам удалось измерить активность мономеров и тетрамеров
глицеральдегид-3-фос-
фатдегидрогеназы при концентрациях НАДН от
0,6 до 60 мкМ [24]. Для проведения эксперимента иммобилизованные формы
глицеральдегид -3 - фосфатдегидроге-назы смешивали с иммобилизованной
отдельно на сефарозе лактатдегидрогеназой, с НАДН в указанных на рис. 3
концентрациях и с субстратами обоих ферментов. НАДН окислялся лактат-
2А
IV
I"
Г
§ 'Ц?-1____I___I_______I_I I дегидрогеназой, и образующийся
^ Цо 10 20 30 ьо S0 60 НАД использовался в глицераль-
[НАДН^мкМ дегид - 3 - фосфатдегидрогеназной
Рис. 3. Зависимость удельной ак- реакции. После завершения
реактивности иммобилизованных моно- ции инкубационную смесь отде-меров
(/) и тетрамеров (2) гли- ляли от иммобилизованных фер-церальдегнд - 3 -
фосфатдегидроге- ментов фильтрованием и опреде-назы от концентрации
кофактора -гг г
v v ляли активность глицеральдегид-
