Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
и изменением ферментативной активности КФ. Повышение активности
нефосфорилированной КФ отчетливо коррелировало в работе Бугера и др.
[151] со связыванием трех молекул Са2+ в расчете на оф-уб; одна из них
имела более высокое сродство (/Cd=0,31 мкМ), чем две другие (/Cd=2,15
мкМ). Влияние четвертой молекулы Са2+ авторам определить не удалось, так
как в используемых ими экспериментальных условиях при концентрации Са2+
100 мкМ фермент выпадал в осадок.
Весьма сложная зависимость между активацией фермента и связыванием
металлов была выявлена в присутствии Са2+ и Mg2+ [155, 156]. На основе
полученных данных авторы пытались дифференцировать центры связывания
металлов, ответственные за специфичность фермента, используя в качестве
субстратов ФБ, тропонин и собственную молекулу фермента, а также центры,
ответственные за активность КФ при различных значениях pH. В зависимости
от условий эксперимента (pH, ионной силы и концентрации металлов)
рассматривались три типа активности: Ао, А\ и Лг. Первый тип активности -
А0, - независимый от Са2* составлял незначительную часть общей активности
и выявлялся при очень низкой концентрации Са2+. При связывании Са2+ в
Ca2+/Mg2+-neHTpax, характеризующихся высоким сродством к Са2+,
проявлялась активность А\. Вторая стадия активации фермента, связанная с
активностью Аг, происходила, когда были заняты Са2+-специфические центры,
индуцированные в присутствии вы-' сокой концентрации Mg2*- [155].
О существенном значении Mg2+ для Са2+-зависимой регуляции активности
КФ можно судить также на основании результатов определения ферментативной
активности при pH 6,8 после предынкубации неактивированной КФ с металлами
[159, 160]. Короткая инкубация (1,5 мин) с одним из металлов не влияла на
активность, в то время как при их совместном добавлении активность при pH
6,8 возрастала в 7 раз, при этом исчезала характерная для
неактивированной КФ лаг-стадия. Если активность определяли при pH 8,2 или
предварительно активировали фер-
71
мент самофосфорилированием, то никакой активации металлами не
обнаруживали. Синергизм действия Са2+ и Mg2+ оказывал влияние на
кинетические характеристики фермента.
Как мы уже отмечали, разные формы КФ сильно отличаются по сродству к
Са2+ [9, 19]. Концентрация Са2+ для полумакси-мальной активации (Сад)
неактивированной КФ при pH 6,8 и 8,2 соответственно равна 23 и 16 мкМ
[19]. Эти величины на порядок выше, чем найденные в более ранней работе
[9]. Но при активации фермента фосфорилированием или путем ограниченного
протеолиза величина С0,5 значительно уменьшалась. Связано ли это с
повышением сродства 6-субъединицы к металлу или с каким-то другим
механизмом, пока не ясно. Можно, например, предположить, что Са2+-
связывающие центры настолько высоко дифференцированы, что в зависимости
от формы фермента присоединяется меньшее или большее число молекул Са2+.
Однако экспериментальных доказательств для такого предположения пока не
существует.
В настоящее время еще нет достаточной ясности относительно
взаимодействия КФ с ионами Mg2+. Помимо того что уже было описано выше,
можно отметить участие его в образовании комплекса КФ с гликогеном [47],
а также участие в катализируемой киназой реакции путем образования
комплекса Mg-АТФ [3]. Однако характер влияния свободного Mg2+ на
ферментативную активность является спорным. Имеющиеся сведения довольно
противоречивы. Клерх и др. [161] нашли стимулирующий эффект свободного
Mg2+ на активность неактивированной КФ в условиях насыщающей концентрации
Mg2+-AT(r), постоянной концентрации, АТФ и варьирующей концентрации Mg2+.
Известны, однако, и другие данные, показавшие, что в зависимости от
концентрации металла проявлялось активирующее или ингибирующее действие
[162]. Более детальное выяснение роли Mg2+ в механизмах регуляции
активности фермента, безусловно, представляет большой интерес для
дальнейших исследований.
Значение Са2+ состоит не только в том, что он непосредственно
активирует КФ, но и влияет на некоторые белки, КМ и тропонин С, превращая
их в активаторы фермента.
Активация КФ добавленным КМ была обнаружена почти одновременно в двух
разных лабораториях [18, 111]. Она была обусловлена связыванием в
присутствии Са2+ второй молекулы КМ (б'-субъединицы) со вторым КМ-
связывающим центром на молекуле фермента. Опыты, в которых совместно с КМ
и Са2+ добавляли антипсихотропный агент - трифлуороперазин или тропонин
I, специфически связывающие КМ, демонстрировали полное отсутствие
активации КФ, при этом наблюдалось сохранение зависимости ферментативной
активности от Са2+ [16, 18]. Существование второго центра для связывания
КМ было обнаружено также при взаимодействии КФ с кальмодулин-сефарозой 4В
в присутствии ионов Са2+. Связавшийся фермент отделялся от сорбента
элюирующим буфером, содержащим ЭГТА [18, 111]. Все эти данные
72
указывали, что б'-субъединица не прочно связывалась с ферментом и при
