Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
электронномикроскопические исследования [124]. Сшивающий агент может
взаимодействовать с компонентами комплекса, расположенными на достаточно
близком расстоянии друг от друга. Так, например, полученный после сшивки
полипептид с м. в. 60 000 [122] был расшифрован как комплекс, состоящий
из двух субъединиц - уб. Исследуя субъединичную структуру сшитых
комплексов на основе их чувствительности к действию определенных
протеиназ, можно было предположить, что полученные сочетания субъединиц -
уб, Руг, оф, аа - обусловлены более тесным контактом их в
пространственной организации молекулы. Исследование КФ методом
электронной микроскопии показало, что молекула имеет форму буквы Н: она
представляет собой структуру, состоящую из двух больших доменов,
соединенных узким мостиком. Каждый домен разделен на две половины, и
мостик находится около участка их соединения. Размеры больших частей
позволяют предположить наличие 2а- и 2р-субъединиц в каждой части.
Мостик, соединяющий эти части, может включать в •себя у-субъединицы. На
основе данных электронной микроскопии и результатов, полученных при
сшивании субъединиц, была предложена гипотетическая схема строения КФ,
согласно которой 2а-•и 2р-субъединицы находятся в множественных
контактах, а мостик, состоящий из 4 у-субъединиц, расположен таким
образом, что р-субъединица одновременно может контактировать с 2у-
субъеди-ницами [123, 124].
Между тем появился ряд работ, сообщавших новые сведения о
функциональной роли р-субъединицы. Это направление исследований
представлено работами, в которых широко использовались различные аналоги
субстрата ¦- АТФ. В нашей работе были испытаны аналоги АТФ, содержащие
алкилирующую группировку в трифосфатном участке молекулы [62, 63]. Среди
испытанных аналогов АТФ наиболее эффективным ингибирующим действием
характеризовался аденозин-5'-хлорметанпирофосфонат, образующий
необратимый фермент-ингибиторный комплекс. Наблюдаемый защитный эффект
АТФ и стехиометрическое включение радиоактивных аналогов в молекулу КФ
указывали на то, что эти соедине-
64
ния взаимодействуют с функциональными группами активного центра и,
следовательно, связывались с теми субъединицами, на которых локализованы
активные центры фермента. При изучении включения радиоактивной метки,
содержавшейся в аналогах АТФ, мы получили доказательство того, что они
присоединяются к р- и у-субъединицам. Для полной инактивации фермента
было достаточно, чтобы по одному молю аналога присоединилось к р-и ¦у-
субъединицам. Найденная нами зависимость между степенью инактивации
фермента и степенью модификации р-субъединицы позволяет трактовать
полученные данные как доказательство участия р-субъединицы в
каталитическом процессе (табл. 2).
Весьма сходные результаты получены недавно другими авторами [125-
128], наблюдавшими влияние ряда соединений, близких по структуре к АТФ,
на ферментативную активность и на взаимодействие с субъединицами КФ.
Полученные ими данные показали, что используемые соединения конкурируют
за места связывания с АТФ или АДФ. Анализ взаимодействия с [у- 32Р] 8-
азидоаденозии-5'--трифосфатом указывал на преимущественное мечение р-
субъединицы фермента и на защиту ее от включения метки в присутствии АТФ
или АДФ [127, 128|. Таким образом, влияние аналогов АТФ на ферментативную
активность в сочетании с включением их в р- и ^-субъединицы позволяет
полагать, чтор-субь-единица играет существенную роль. Подтверждают эту
точку зрения также данные недавно опубликованной работы, проведенной на
КФ из сердца быка [38].
Поскольку выделить в индивидуальном виде р-субъединицу пока не
удалось, нельзя решить однозначно, какова ее роль в каталитическом
процессе. Однако для выяснения этого вопроса помимо вышеописанных могут
быть использованы и другие подходы. В частности, могут быть полезны
методы химической модификации функциональных групп, вовлекаемых в
ферментативную реакцию или в регуляцию активности фермента. С этой целью
проводилось изучение содержания и реакционной способности SH-групп КФ. В
денатурированной молекуле определили 160 [20] или 200 [23] остатков
цистеина. В работе этих же авторов было замечено, что SH-группы
характеризуются различной реакционной способностью, но детально значение
их не исследовалось.
В нашей работе было показано, что блокирование SH-rpynn
дитионитробензоатом и йодакетамидом, обладающих наиболее высокой
реакционной способностью, связано с активацией фер-
Таблица 2
Зависимость степени инактивации КФ от степени
модификации |3- и Y-субъединиц фермента аденозин-5'-хлорметапирофосфатом
Остаточная Количество аналога,
активность [связанного с субъединицами,
фермент-инги моль/моль артб.
3-субъеди Y~ субъеди
ница ница
90 0.1 1,0
50 0,4 1.2
0 о 1,3
