Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
до 48 000. На основе определения молекулярных весов и их весовых
соотношений рассчитывали стехиометрию субъединиц [20, 23]. Результаты,
полученные разными методами исследования,
S6
показали, что субъединицы присутствуют в эквимолярных количествах и м. в.
протомера равен 320 000 [23]. Не всегда, однако, соблюдалось такое
соотношение субъединиц. Так, в работе Хаякавы и др. [20] оно было равно
1:1:2, а при анализе КФ из мышц тихоокеанской акулы (Squalus acanthias)
нашли, что отношение между а- и р-субъединицами сохраняется постоянным, а
соотношение у-субъединицы варьирует от 1 до 8 и более [54]. Исследуя
природу этого явления, авторы установили сходство между у-субъ-единицей и
G-актином. Оба белка имеют одинаковый молекулярный вес (45 000) и сходный
аминокислотный состав, за исключением 3-метилгистидина, найденного только
в молекуле G-актина.
Наличие а'-субъединицы явилось следствием различия субъеди-ничного
состава КФ в красных и белых мышцах [22, 25], и количество ее отражает
соотношение белых и красных мышц в смеси мышц конечностей и спины,
используемых обычно для выделения фермента. В препаратах КФ из мышц
кролика соотношение а : а' равно 10 : 1, а для мышиного фермента -
отношение а : а' равно
1 : 1 [45]. И действительно, в белых и красных мышцах было показано
существование 2 изозимов [55]. Благодаря тому что изозимы обладают
различным сродством к Са^, их удалось разделить на колонке с
кальмодулинсефарозой 4В [46].
Исходя из молекулярного веса фермента, равного в среднем 1,3 x10е, и
молярных соотношений субъединиц, принято считать, что структура КФ из
скелетных мышц отвечает формуле ("Руб)4 или (а'Руб)4- Выделенная в
гомогенном состоянии КФ из сердца также содержит по 4 моля а- и р-
субъединиц, а количество у-субъединицы все же варьирует от 1 до 5, 6
[37,38].
В лаборатории Хейльмейера была выделена КФ из мембран саркоплазм
этического ретикулума, в структуре которой не обнаружено у-субъединицы
[56]. Высокоочищенный фермент печени имел структуру, сходную с мышечной
КФ [42, 57]. Как уже указывалось, КФ в нативном состоянии не диссоциирует
на субъединицы. Попытки вызвать диссоциацию путем разведения, повышением
ионной силы в присутствии солей NaCl, КС1, NaN03, NaCI04, выдерживанием
при низкой температуре не увенчались успехом
[3]. Однако в работе Скастера и др. [58] удалось отделить у-субъединицу
от комплекса путем обработки фермента 1,8 М. LiBr в присутствии 100 мМ
АТФ. Авторы получили при этом белок с м. в. 86 000, считая его димером
уг- В дальнейшем в той же лаборатории таким способом были изолированы два
комплекса - уб и ауб, которые, как и уг, обладали ферментативной
активностью [59].
Вопрос о наименьшем молекулярном весе активной формы нативного
фермента до сих пор не нашел разрешения. Исследования КФ, активированной
путем фосфорилирования [3,6], органическими растворителями [60], не дали
ответа. Оказывает ли действие белковый субстрат ФБ на четвертичную
структуру КФ, пока тоже не ясно. Хотя, если учесть, что между ФБ и КФ
обнаружено образование комплекса с м. в. 750 000, то как будто такое
влияние
S7
имеет место [61]. С другой стороны, ВЫЯСНИЛОСЬ, что, в отличие от
неактивированной киназы, КФ, активированная протеолизом в присутствии АТФ
при 5°С, превращается в компоненты с мень-шим молекулярным весом - 350
000 и ниже [3]. Основываясь, однако, на результатах кинетики
ингибирования КФ аналогами АТФ, инактивация фермента происходила при
связывании 4 молекул необратимого ингибитора на молекулу киназы, и,
следовательно, это указывало, что активной является высокомолекулярная
форма фермента (аРуб)4 [62, 63].
Специфичность киназы фосфорилазы
Фишер и сотр. [64] установили, что продукт киназной реакции ФА
характеризуется наличием фосфосеринового остатка. В полученном путем
протеолиза ФА гексапептиде, а затем тетрадека пептиде [65], содержащем
центр фосфорилирования, была определена последовательность аминокислот и
показано, что фосфорилирован-ный остаток серина, занимающий положение 14
от N-конца, окружен двумя гидрофобными аминокислотами - изолейцином и
Валином, рядом с последним находится аргинин:
Лиз-Глн-Иле-(Сер-Р)-Вал-Арг.
14 15 16
Эта последовательность аминокислот повторяется у фосфорилаз различных
животных и человека [23, 66-68], и, по всей вероятности, поэтому КФ из
мышц кролика способна катализировать фосфорилирование всех до сих пор
известных фосфорилаз животного происхождения [68], в то время как
дрожжевую ФБ, имеющую в этом участке иную последовательность, КФ не
фосфорили-рует [69]. Специфичность действия КФ исследовали с помощью
синтетических пептидов. Кинетические свойства неактивированной и
активированной КФ, изученные в модельной системе, содержащей вместо ФБ
синтетический тетрадекапептид, указывали на сходство величин константы
Михаэлиса Кт для ФБ и пептида и на различие величин Vm [70, 71].
