Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
фактор (КАФ), повышающий активность фермента при pH 6,8 [113-115]. Этим
фактором оказалась Са2+-зависимая протеиназа [116]. Эффект активации
фермента при ограниченном протеолизе трипсином и химотрипсином наблюдали
также при изучении КФ из сердца и мозга [38, 115, 117]. Активирующее
действие эндогенных протеиназ выявлялось при хранении ¦очищенных
препаратов КФ, которые за две недели при 4°С активировались в 12 раз
[23]. Имеет ли физиологическое значение активация КФ протеолизом, пока
остается неясным. Однако он широко использовался для изучения
регуляторных свойств и функциональной роли субъединиц КФ [21, 23, 54,
112, 113, 118, 119]. В нашей работе с этой целью был применен субтилизин,
действие которого вызывало 10-кратное увеличение активности КФ при pH
6,8. Одновременно с активацией фермента исчезала зависимость активности
от Са2+. Такое же явление оказывало действие трипсина [14]. Протеолиз КФ
субтилизином протекал более медленно, чем протеолиз трипсином, и это
давало возможность детально анализировать изменение активности и
структуры фермента во времени. Под действием протеиназ первой разрушалась
-а-субъединица. Если сравнить активацию фермента цАМФ-зави-•симой
протеинкиназой, которая главным образом зависела от фосфорилирования р-
субъединицы, то активация протеолизом коррелировала с деградацией а-
субъединицы. Следовательно, механизмы этих двух путей активации
различны,, хотя в обоих случаях
62
повышалось сродство к белковому субстрату. Можно предположить, что в
молекуле КФ, как и других регуляторных ферментов, каталитический
компонент поддерживается в неактивном состоянии за счет взаимодействия с
регуляторным, функцию которого выполняет, по-видимому, а-субъединица.
Фракционирование фермента, обработанного субтилизином, на колонке с
фосфоцеллюлозой позволило разделить две фракции. Наиболее слабо связанная
с ионообменником фракция, обладавшая активностью при pH 6,8,
характеризовалась полным отсутствием зависимости фермента от ионов Са2*
(рис. 2) [48, 112]. Анализ этой фракции методом гель-хроматографии и
электрофореза в градиенте полиакриламидного геля показал, что она
представляет собой полипептид с м. в. 80 ООО-90 ООО [34, 113]. В процессе
протео-лиза вслед за исчезновением а-субъединицы начиналась деградация
р-субъединицы;
у-субъединица оставалась без изменения [21-23, 34, 48]. Устойчивость
у"сУбъеДиницы к протеолизу служила одним из аргументов, позволившим
предположить ее ответственной за выполнение каталитической функции
[3,21]. Однако, обработав КФ из мышц акулы и кролика химотрипсином, по
отношению к которому оказалась устойчивой р-субъединица, Фишер и сотр.
[54, 118,119] получили данные, указывающие на каталитическую роль р-
субъединицы. Спустя несколько лет появилась работа Скастера и др. [58], в
которой сообщалось, что 1,8 М LiBr в присутствии 100 мМ АТФ оказывает
эффективное действие на диссоциацию КФ, в результате чего удалось
отделить и очистить обладающую ферментативной активностью -у-субъединицу.
Полученная у-субъединица в виде димера у2 с м. в. 86 ООО была активна при
pH 6,8. В отличие от холофермента - у-субъединица полностью теряла
зависимость активности от ионов Са^. В следующей серии работ эти же
авторы также с помощью LiBr изолировали два комплекса - -уб и ссуб [59,
120, 121]. Комплексы характеризовались частичной потерей чувствительности
к Са2_г, более высокой величиной константы Михаэлиса для АТФ, чем
нативная неактивированная КФ. В то же время сродство комплексов к ФБ
практически не изменялось. Добавление гликогена не приводило к активации
-уб, характерной для холофермента, но актив-
!
Фракции
Рис. 2. Хроматографическое разделение киназы
фосфорилазы, обработанной суб-тилизнном.
На колонку с фосфоцеллюлозой наносн-ли 5,4 мг КФ, обработанной субтнлизи-
ном в течение 16 ч. Элюцию проводили в линейном градиенте концентрации Р-
глицерофосфата (0,03-0,3 М); определение активности проводили прн pH 6,8.
1 - выход белка, 2 - активность КФ в присутствии
Са2+, 3 - активность в отсутствие Са2+
6Х
ность ауб комплекса повышалась. Из результатов работы можно было сделать
заключение, что а-субъединица выполняет многие регуляторные функции, а
каталитическими свойствами наделена •у-субъединица. Следует также
отметить, что сложно устроенная структура КФ и большой размер молекулы
связаны с многообразными регуляторными свойствами фермента, в то время
как катализировать ферментативную реакцию могли даже небольшие фрагменты,
полученные после протеолиза КФ субтилизином [34, 48], химотрипсином [54,
118, 119], и выделенная из молекулы белка с помощью LiBr усубъеднница
[58, 120, 121J.
Не вызывает сомнения, что регуляция активности фермента тесно связана
с пространственной организацией молекулы белка. В связи с этим
безусловный интерес представляют результаты, полученные методом
поперечной сшивки с помощью диметилсубе-римидата [122, 123] и
