Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
¦I
о
3 Заказ 423
65
мента, в то время как медленно реагирующие SH-группы, подразделявшиеся на
две категории, имели существенное значение для проявления ферментативной
активности. Это подтверждалось зависимостью между скоростью блокирования
SH-групп и наблюдавшейся инактивацией фермента [129, 130]. Принимая во
внимание тот факт, что субстрат и продукт реакции, АТФ и АДФ, защищали
фермент от инактивации, мы исследовали зависимость этого эффекта от
концентрации нуклеотидов, добавленных порознь и совместно, и его связь с
модификацией SH-групп. Результаты титрования, приведенные в табл. 3,
позволили прийти к заключению о пространственной разделенности защищаемых
SH-rpynn и о локализации их в области нуклеотид-связывающих центров. На
основе зависимости защитного действия нуклеотидов от их концентрации
можно было предположить что два остатка цистеи-на находятся в области
АТФ-связывающих центров, отличающихся по сродству к субстрату, а один
остаток - в области нуклеотид-связывающего участка, имеющий большее
сродство к АДФ. Количество защищаемых нуклеотидами SH-групп не зависело
от присутствия ионов Mg2+.
Следующий этап нашей работы был связан с выяснением локализации SH-
групп, важных для ферментативной активности, в субъединицах КФ. Для этого
препараты фермента, предварительно обработанные иС-йодацетами-дом в
присутствии и в отсутствие
Таблица 3
Влияние АТФ и АДФ на защиту остатков цистеина киназы фосфорилазы от
модификации __________дитионитробензоатом______
ОСУ?
Условия
Количество защищаемых -J-SN-групп
на протомер "Pv6
АТФ (0,05 мМ)
АТФ (0,3 мМ)
АТФ (3,0 мМ)
АДФ (0,05 мМ)
АДФ (0,3 мМ)
АДФ (3,0 мМ)
АТФ (0,3 мМ)+АДФ (О.ЗмМ) АТФ (0,3 мМ)+АДФ (3 мМ) АТФ (3 мМ)+АДФ (3 мМ)
0,98±0,29
0,83+0,26 2,63+0,20 1,16±0,10 0,68±0,20 1,96±0,15 1,98±0,10
1,95+0,47 2,88±0,33
Примечание. Концентрация киназы
- 0,4 мг/ мл; дитионитробензоата - 40 мкМ.
Рис. 3. Взаимодействие [мС]-йодацетамида с
субъединицами киназы фосфорилазы.
КФ (0,4 мг/мл) инкубировали с [14С]-йодацетамндом при 30°С в 50 мМ р-
глице-рофосфатном буфере (pH 7,5), содержащем 10%-н\!ю сахарозу, 1 мМ
ЭГТА. Радиоактивность измеряли в срезах полиакриламидного геля,
полученных после электрофореза в присутствии DS-Na.
1 - в отсутствие Mg-АТФ,
2 - в присутствии 10 мМ
MgClfc и 3 мМ АТФ
66
АТФ, анализировали путем электрофореза. Рис. 3 демонстрирует включение
радиоактивной метки в субъединицы фермента. Как видно, в присутствии АТФ
радиоактивность а-субъединицы не изменялась, а включение радиоактивности
в р- и -у-субъединицы заметно уменьшалось. Этот результат подтвердился
при поэтапной обработке КФ йодацетамидом. На первом этапе инкубировали КФ
с нерадиоактивным йодацетамидом в присутствии АТФ, а после диализа этот
же препарат фермента обработали [ИС]-йодацетамидом. Защищенные в
присутствии АТФ SH-группы на первом этапе обработки прореагировали с
[ИС]-йодацетамидом на втором этапе. Радиоактивность в этом опыте была
обнаружена на р- и у-субъединицах [130]. Взаимодействие КФ с [14С]-йод-
ацетамидом в присутствии варьирующей концентрации АТФ или АДФ позволило
подтвердить предположение о наличии двух ну-клеотид-связывающих центров
на р-субъединице и одного на "у-субъединице.
Таким образом, накопленные к настоящему времени результаты
поддерживают гипотезу о значении р-субъединицы для каталитического
процесса. Однако, участвует ли она непосредственно в реакции или
выполняет регуляторную роль, влияя на ферментативную реакцию, путем
кооперативных взаимодействий р- и *у-субъединиц, в настоящее время
остается неясным.
Регуляция активности киназы фосфорилазы
ионами Са2+ и кальмодулином
Одной из особенностей функционирования КФ скелетных мышц является полная
зависимость ее активности от ионов Са2+, обнаруженная впервые в работе
Фишера и Кребса [131]. Особый интерес к исследованию этого явления
появился после того, как была показана обратимость активации фермента при
низкой концентрации Са2+ [132] и когда в ряде работ подтвердилось, что КФ
проявляет свою активность при физиологической концентрации металла [9,
132, 133]. Количество Са2+ в цитоплазме мышечной клетки, как известно,
зависит от состояния ткани. Установлено, что переход от покоящегося в
возбужденное состояние сопровождается изменением концентрации Са2+ от 10-
8-10~7 до 10-е-10~5 М [134]. Такое изменение концентрации свободного Са^
обусловлено механизмом сокращения мышц, связанным с .выбросом Ga2+ в
цитоплазму из саркоплазматического ретикулу-.ма, в котором локализована
большая часть внутриклеточного Са2+.
Несмотря на то что многие вопросы сложных взаимодействий фермента с
