Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
скелетной мускулатуре
адреналин
аденилатциклаза аденилатциклаза
(неактивная)
АТф цАМф
прогеинки нала (неактивная)
протеинкиназа
МЕ2+-АТф (Са2+)
киназа ФБ киназа Ф
гликогенсинтаза гликогенсинтаза фосфорилаза Б фосфорилаза А (неактивная)
(неактивная)
Рн
. гликоген гликоген
(п) (п \)
60
в среду при перфузии изолированного сердца крысы приводило к быстрому
увеличению активности ФА и увеличению уровня цАМФ [36, 86-90]. Наличие
зависимого от цАМФ механизма активации КФ установлено также для гладкой
мускулатуры [91, 92]. Адени-латциклазная система обеспечивает регуляцию
активности КФ не только адреналином, но и другими гормонами. Так, было
показано, что глюкагон активировал фосфорилирование КФ путем увеличения
уровня цАМФ в печени [40].
В настоящее время известно, что очищенные препараты КФ in vitro могут
фосфорилироваться другими протеинкиназами: цГМФ-зависимой i[93], Са24-- и
фосфолипид-зависимой [94, 95], цАМФ-не-зависимой [96], цАМФ- и Са^-
независимой [97]. Однако наиболее высокая степень активации КФ происходит
под действием цАМФ-зависимой протеинкиназы; именно этот процесс является
ключевой ступенью в регуляции гликогенолиза. В последние годы большое
внимание было уделено изучению молекулярных механизмов активации КФ.
Считают, что полностью дефосфорилированная КФ характеризуется
отношением активностей при pH 6,8 и 8,2, равным 0,01-
0,05. При инкубации такого фермента с цАМФ, АТФ, Mg2+ и про-теинкиназой
активность КФ возрастала при pH 6,8 в 25-50 раз, а при pH 8,2 -в 1,4
раза, т. е. отношение увеличивалось до 0,36 [3, 21, 23]. Активацию КФ
цАМФ-зависимой протеинкиназой проводили при низкой концентрации АТФ (0,2
мМ) и Mg^ (2,0 мМ), чтобы исключить аутофосфорилирование. Установлено что
в этих условиях происходит включение 2 молей фосфата на моль сфуб.
Активация КФ коррелирует с внедрением 1 моля фосфата в. Р-субъединицу; а-
субъединица фосфорилируется более медленно, и ранее считали, что ее
модификация не влияет на активность-фермента [23, 24, 98]; ^-субъединица
не подвергалась фосфорили-рованию [21, 23]. Доказательством
фосфорилирования а- и
р-субъединиц служили опыты с использованием протеин-гликоге-новых частиц
[99-102]. Кроме того, была показана идентичность фосфопептидов,
выделенных из а- и р-субъединиц после фосфорилирования КФ in vitro [98] и
из КФ, активированной внутривенным введением кролику адреналина .[101].
Коэн и Антонив [102, 103] предположили, что фосфорилирование а-
субъединицы связано с регуляцией процесса дефосфорилирования р-
субъединицьи Однако работы последнего времени позволили пересмотреть эту
точку зрения. Были подобраны условия, в которых а-субъединица не
оказывала влияния на дефосфорилирование р-субъединицы [104-107]. Кроме
того, с помощью различных протеинкиназ, фос-форилирующих КФ, показали,
что на а- и р-субъединицах фосфо-рилируются одни и те же остатки серина,
причем во всех случаях, р-субъединица фосфорилируется быстрее, чем а- или
а'-субъеди-ница. Но более полная активация КФ зависит от фосфорилирования
обеих субъединиц .[21, 96, 97, 106].
При высоких концентрациях Mg2+ (ЮмМ) и АТФ (ЗмМ) КФ способна
катализировать фосфорилирование своей собственной мо-
61
лекулы, сопровождающееся активацией фермента. Эта реакция полностью
зависит от Са2+ и ингибируется ЭГТА [3, 33, 47, 108]. В условиях
благоприятных для аутофосфорилирования (ЗмМ АТФ, 10-20 мМ Mg^),
происходило включение фосфата в а- и {3-субъединицы фермента. Характерной
особенностью этого процесса является также зависимость его от pH [3,
109]. При pH 8,2 оно происходит быстрее, чем при pH 6,8, при этом в р-
субъединицу фосфат внедряется с постоянной скоростью при любом pH, фосфо-
рилирование а-субъединицы при pH 6,8 имеет лаг-стадию [3, 21, 110].
Внедрение максимального количества фосфата, равного
7-9 молям на 1 моль сфуб, приводит к активации фермента, в 2-3 раза
превышающей активацию при фосфорилировании цАМФ-зависимой протеинкиназой.
Хотя механизм аутофосфорилирования остается неясным, на основании
имеющихся экспериментальных данных можно заключить, что КФ,
активированная самофосфорилированием, характеризуется большим сродством к
ионам Са2* и к субстрату (ФБ). Кроме того, установлено, что в молекуле
фермента различаются' два типа остатков серина. Два.остатка 1-го типа
модифицируются при низкой концентрации Mg2+ и АТФ, остальные 5-7 остатков
2-го типа фосфорилируются более медленно и только при высокой
концентрации Mg-АТФ [3, 108, 110].
Известен еще один способ активации КФ, связанный с действием
протеолитических ферментов [23, 24, 48, 111-113]. В ранних работах в
препаратах КФ из мышц был обнаружен белковый "ки-назо-активирующий"
