Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
Определив, что первые шесть аминокислот не имеют существенного значения
для активности КФ, авторы использовали в дальнейшем октапептид,
соответствующий центру фосфорилирования, и его аналоги [72]. Оказалось,
что для узнавания центра фосфорилирования важными являются шесть
аминокислот, среди которых особое значение имеют гидрофобные
аминокислотные остатки - Вал-15 и Иле-13, а также Арг-16.
В последние годы выяснилось, что КФ может фосфорилировать не только
ФБ и собственную молекулу, но и ряд других белков, таких, как ГС [12, 13,
73] и компоненты тропонинового комплекса, тропонин Т и тропонин I [74,
75]. Фосфорилируемый участок в тропонине 1 очень сходен с центром
фосфорилирования ФБ, за исключением того, что вместо серина он содержит
треонин. Однако скорость фосфорилирования тропонина во много раз ниже,
чем
S8
ФБ [75]. В молекуле ГС киназа катализирует фосфорилирование одного
остатка серина, находящегося на 7-м месте от N-конца [12, 13, 76, 78]. В
табл. 1 приведены фосфорилируемые киназой пептидные фрагменты, полученные
из ФА, ГС и тропонина J. Участие КФ в фосфорилирования специфического
центра ГС было показано как на очищенных препаратах, так и на ферменте,
входя-
Таблица 1
Аминокислотная последовательность центров, фосфорилируемых КФ
Белок Последовательность аминокислот* Ссылка
Г ликогенфосфо- 10 14 [65, 77]
рилаза Г лу-Л из-Арг-Лиз-Г лн-Илс-Сер (Р) - [12, 13 , 78 , 79]
Гликогенсинтаза -Вал-Лей-Ала-Г ли-Вал-Глу [75]
Тропонии / 20
1 5 7
Про-Лей-Сер-Арг-Т ре-Лей-Сер (Р) -
-Вал-Сер-Сер-Лей-Про-Гли-Лей-Глу
10 15
11
Apr-Ала-Иле-Т ре (Р) - А ла-А рг
* Числа указывают положение аминокислот от N-конца каждого фермента.
щем в состав гликоген-белкового комплекса [80]. Величины Кт для ФБ и ГС
примерно одинаковы, в пределах 50-100 мкМ, а скорость реакции в случае ГС
в 2-3 раза ниже. Этот факт свя-¦за:1, возможно, с тем, что концентрация
фосфорилазы в клетке выше по сравнению с ГС и соответственно равна 100 и
4 мкМ [80]. К характеристике субстратной специфичности относится также
способность КФ фосфорилировать казеин [81]. В гетерогенной молекуле
казеина специфичным для КФ оказался ^-казеин, в котором фосфорилировался
остаток серина. Для полумаксималь-ной активности фермента требовалась
концентрация казеина 80 мкМ, т. е. концентрация, близкая к величине Кт
для других субстратов, ФБ и ГС. Полученные результаты авторы использовали
для обсуждения вопроса о количестве активных центров в молекуле КФ и
склонны были считать, что каталитическую функцию выполняет одна
субъединица. Однако в связи с широкой специфичностью КФ высказывалась и
другая точка зрения - о возможном существовании двух активных центров в
молекуле фермента '[82]. Следует отметить, что в литературе по этому
вопросу нет единого мнения. В настоящее время проводятся интенсивные
исследования по изучению роли субъединиц в регуляции активности КФ и
участия их в каталитическом процессе.
S9
Роль субъединиц в регуляции и каталитической активности КФ
Активация КФ под влиянием адреналина была замечена задолго до открытия
цАМФ-зависимой протеинкиназы. В опытах in vivo и на очищенных препаратах
КФ [6, 83, 84] это наблюдение привело к тому, что был открыт фермент,
присутствующий в следовых количествах в препаратах КФ [7, 21, 23].
Фермент был выделен в гомогенном состоянии из ряда источников. Он состоит
из двух типов субъединиц: регуляторной, связывающей цАМФ, и
каталитической, на которой локализован активный центр. При образовании
комплекса цАМФ с регуляторной субъединицей молекула фермента диссоциирует
с выделением свободной каталитической субъединицы, способной
фосфорилировать КФ [3,85]. Влияние адреналина на превращение ФБ в ФА в
скелетной мышце связано с увеличением концентрации внутриклеточного цАМФ.
Образовавшаяся при этом цАМФ-зависимая протеинкиназа, фосфорилируя КФ,
пере-Еодйт ее в активированную форму, в свою очередь фосфорилирую-щую ФБ,
вызывая тем самым активацию гликогенолиза. Таким образом, адреналин
стимулирует деградацию гликогена посредством "каскадного" механизма,
включающего активацию нескольких ферментных систем (рис. 1).
Справедливость приведенной схемы была доказана экспериментально не
только для скелетной мускулатуры, но и для других тканей. Стимуляция
гликолиза адреналином в сердечной мышце также связана с активацией КФ
[37, 38]. Добавление адреналина
Рис. 1. Каскад реакций, связанный с регуляцией распада и синтеза
гликогена в
