Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
предположение. По данным Коэна [19], концентрация Са2+ для
полумаксимальной активации даже при незначительной деградации КФ
трипсином равна 0,05 и 0,07 мкМ соответственно при pH 8,2 и 6,8, что в
300 раз ниже, чем для неактивированной КФ. После протеолиза КФ трипсином
[14] ее активность и активность выделенных из неактивированной киназы
комплексов \6 и а\8 на 25-30% проявлялась в отсутствие Са2+ [59, 120], а
низкомолекулярный фрагмент, полученный после протеолиза КФ субтилизином,
вообще не требовал для своей активности добавления металла (см. рис. 2)
[34].
После того как в составе КФ был открыт термостабильный компонент,
активирующий фосфодиэстеразу циклических нуклеотидов в присутствии Са2+,
и было установлено, что этот белок, сходный по своим свойствам с КМ,
является четвертой б-субъеди-ницей фермента [49, 149], появились новые
работы, уделившие большое внимание детальному анализу Са2+-связывающих
свойств изолированной 6-субъединицы и в составе комплекса с КФ.
Известно, что КМ широко распространен в животных тканях и, являясь
основным цитоплазматическим рецептором Са2+, уча-
69
ствует в регуляции ферментов обмена гликогена и сократительных белков
мышц. Связывание КМ с различными белками происходит при физиологической
концентрации Са2+, а в отсутствие металла КМ отделяется от белков и
находится в свободном состоянии. Среди известных ферментов, зависимых от
КМ и от Са2+, КФ является единственным, содержащим прочносвязанный КМ (б-
субъединицу), который не отделяется даже при обработке 8 М мочевиной при
полном отсутствии Са2+ [122]. Количество КМ, связанное в комплексе с
субъединицами КФ, составляет около половины всего белка, имеющегося в
мышцах [18, 24, 150]. В настоящее время вполне обоснованным можно считать
мнение о том, что в молекуле КФ б-субъединица является ответственной за
связывание Са2+ [24, 151]. Теперь, когда стала известна функция
8-субъединицы, можно было оценить кинетические свойства Са^-связывающих
центров, используя различные экспериментальные условия и методические
приемы, как гель-фильтрацию, равновесный диализ, электрометрическое
титрование, метод абсорбционной спектрофотометрии [19, 151-156]. Как и
другие Са2+-связывающие белки, КМ и тропонин С, б-субъединица
характеризовалась наличием Са2+-связывающих центров, обладающих различным
сродством к металлу [9, 151-153]. Исследуя кинетику связывания Са2+ с КФ
в p-глицерофосфатном буфере (pH 6,8), Килиманн и др. [152] нашли, что в
этих условиях на молекулу фермента (а6уб)4 связывалось 12 Са2+ с
величиной константы диссоциации (Kd), равной 1.5ХЮ-8 М, и 4 Са^ с Kd= =
6х10~7 М. Так как КМ связывал 4 Са^ на моль, то эти данные позволили
считать, что центры связывания металла в молекуле КФ локализованы на б-
субъединице. При измерении констант диссоциации оказалось, что в молекуле
КМ три Са^ имели Kd= = 2хЮ~7 М и один Са2+ - Kd=lXl0-6 М [157, 158].
Сравнение величин констант диссоциации комплексов КФ с Са24- и КМ с Са2+
показывает, что б-субъединица, входящая в структуру молекулы фермента,
связывается с Са прочнее, чем свободный КМ.
Последующий анализ Са2+-связывающих свойств субъединицы, проведенный
в условиях различной ионной силы и в зависимости от присутствия ионов
Mg2+, позволил дифференцировать шесть центров связывания металлов в
расчете на а Руб: два - Ca2+/Mg2+, два центра Са^-специфических и два
центра Mg2+-cпeцифичecкиx [154]. Ранее аналогичные центры были определены
в тропонине С [158]. Добавление Mg2+ оказывало влияние не только на Са^-
связывающие свойства 6-субъединицы КФ, но и на число мест связывания
металла [152-155]. Этот эффект Mg^+ имеющий, возможно, аллостерическую
природу, был связан с хорошо выраженными конформационными изменениями
белка, в результате которых открывались дополнительные центры связывания
Са2+ [151, 152]. Следует отметить, что Mg^ оказывал более сильное влияние
на сродство Са2+ к Са2+-специфическим центрам холофермен-та, чем
изолированной б-субъединицы [151, 154]. При совместном присутствии
металлов наблюдалась конкуренция за центры с вы-
70
соким сродством и это сопровождалось уменьшением константы диссоциации
Са2+ по отношению к Са2+-специфическим центрам. Взаимодействие КФ с Са^ в
присутствии обоих металлов чрезвычайно сильно отражалось на изменении
тирозиновой флуоресценции, свидетельствовавшем о влиянии металлов на
конформа-ционное состояние белка [154].
Таким образом, исследование Са2+-связывающих свойств хо-лофермента и
выделенной из него 6-субъединицы хорошо демонстрировало значение
четвертичной структуры фермента в регуляции его ионами Са2+. По-видимому,
на связывание Са2+ с 6-субъединицей оказывает влияние не только
прочносвязанная с ней -у-субъ-единица [122], но и другие, а- и р-
субъединицы, в отсутствие которых комплекс уб лишь частично проявляет
свою активность без добавления Са2+ [120, 121].
В ряде работ была изучена зависимость между скоростью связывания Са2+
