Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
активность которой при этом подавляется [12-16]. Следовательно, две
противоположные реакции - распад и синтез гликогена - синхронно
регулируются с помощью КФ. Кроме того, предполагается, что участие КФ в
сопряжении процессов гликогенолиза и мышечного сокращения связано с
активацией ее тропо-нином С [17-19].
КФ характеризуется сложной молекулярной структурой: ее
молекула, состоящая из 4 различных субъединиц, имеет молекулярный вес
выше 1 млн. [20-23]. Изучение физико-химических и кинетических свойств и
функции субъединиц направлено на выяснение механизмов каталитической
реакции и регуляции фермента [24].
В настоящей статье мы попытались обобщить накопившиеся в литературе
данные, уделив основное внимание рассмотрению работ, посвященных изучению
молекулярных свойств фермента, роли субъединиц КФ в каталитической
реакции и в регуляции ферментативной активности.
Молекулярные свойства киназы фосфорилазы
В 1956 г. был описан фермент, катализирующий перенос фосфо-рильного
остатка АТФ на ФБ, названный "киназой фосфорилазы"
[1]. Стехиометрия ферментативной реакции соответствовала переносу 4 молей
фосфата на моль ФБ и практически считалась необратимой; 2ФБ+4Л^-АТФ->-
ФА+4 Mg-АДф [25]. Димер ФБ, неактивный в отсутствие АМФ, превращался в
тетрамер фосфорилазы А, не требующий для активности АМФ [26, 27]. Было
показано, что фосфорилирование остатков серина в молекуле ФБ может
происходить поэтапно, так что образуются не полностью фосфорилированные
"гибридные" формы фосфорилазы [28]. Несколько лет тому назад появилась
работа, в которой была обнаружена обратимость киназной реакции [29].
Необходимым условием обратимости реакции являлось присутствие в
реакционной среде глюкозы, связанное, по-видимому, с влиянием ее на
диссоциацию тетрамера ФА на димеры [30, 31]. Очевидно, субстратом КФ
служит димерная форма фермента.
КФ составляет примерно 1 % растворимых белков мышц [3, 23] и находится
в двух молекулярных формах, называемых "активированная" и
"неактивированная" киназа. Максимальная активность обеих форм проявляется
при pH 8,2-9,0. Первая форма почти неактивна при нейтральных pH, а
активность ее при pH 8,2 состав-
55
ляет около 70% от активности второй [21, 23]. Соотношение активностей,
определяемых при pH 6,8 и 8,2, служит мерой степени активации фермента.
Для неактивированной формы это соотношение равно 0,01-0,05, для
активированной - от 0,3 до 1,0. Для проявления ферментативной активности
обе формы киназы нуждаются в присутствии ионов Са2+ [3,21]. Судя по
отношению активностей при pH 6,8 и 8,2, в покоящейся мышце фермент
находится в неактивированной форме, а при возбуждении ткани - в
активированной, при этом при нейтральном значении pH активность
увеличивается в несколько десятков раз [3,32-34].
В высокоочищенном состоянии КФ получена из скелетных мышц [20, 23,
35], сердца [36, 37, 38] и печени 1[39-42], а в частично очищенном виде
она выделена из ряда других тканей. В качестве объектов для выделения
фермента были использованы ткани кролика, акулы, крысы, быка, а также
человека. Разработанный Кребсом и др. {35] метод выделения КФ основан на
изо-электрическом осаждении и дифференциальном центрифугировании.
Дополнительные этапы очистки включают осаждение сульфатом аммония, гель-
хроматографию на сефарозе 4В и ионнообменную хроматографию на ДЭАЭЦ [20,
23]. Описаны и другие методы выделения-с помощью гидрофобной
хроматографии [43], хроматографии по сродству на иммобилизованной
фосфорилазе, специфических антителах, на кальмодулин-сефарозе [44-46].
Очищенная до гомогенного состояния КФ из скелетных мышц представляет
собой большую молекулу с м. в. 1,27x10е-1,33x10е [20, 23, 35].
Коэффициент седиментации ее равен 23-26 5 [20, 23, 47, 48]. При хранении
фермента появляются агрегаты с коэффициентами седиментации 37 5 и 485
[23]. В двух разных лабораториях был определен аминокислотный состав
молекулы КФ [20, 23]. Изо-электрическая точка фермента р! равна 5,77
[21]. В спектре поглощения имеется максимум при 279 нм и минимум при 251
нм [21].
КФ может диссоциировать на субъединицы только после обработки DS-Na.
При электрофорезе в полиакриламидном геле в присутствии DS-Na
дифференцировали сперва три полосы, соответствующие трем субъединицам КФ,
обозначенным а, р, у. Полоса, принадлежащая а-субъединице, была разделена
на две а и а'. Недавно Коэн и др. [49] обнаружили в молекуле КФ еще одну
субъединицу - с м. в. 17 000 - и показали, что по своим физикохимическим
параметрам, первичной структуре [50], а также по функции она близка к
кальмодулину - Са^-связывающему белку, активирующему фосфодиэстеразу
циклических нуклеотидов [51-53]. Ряд авторов проводил определение
молекулярного веса субъединиц [20, 22, 23, 37, 38, 54]. Наибольшие
колебания м. в. наблюдали для а- и р-субъединиц: а - от 118 000 до 145
000, а' - от 133 000 до 140 000, р - от 108 0000 до 130 000, у - от 41000
