Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
которого направлено, например, на стадию 5, не окажет влияния на реакцию
фосфорилирования, но будет сильно влиять на реакцию гидролиза АТФ.
±АТФ ±Ф |
--------> Е - АТФ *Е • АДФ
I 2 |
ч • I3
45
Следует отметить, что существование различных путей синтеза и
гидролиза АТФ в митохондриях в неявном виде неоднократно предлагалось
различными авторами в течение двух последних десятилетий [29-33], однако,
по-видимому, из-за недостаточно четких формулировок подобные гипотезы не
получили развития. Частным случаем общей схемы [28] является
представление, развиваемое Шефером и сотрудниками, согласно которому
электрохимический потенциал ионов водорода является регулятором
соотношения между потоками реагентов, проходящими по пути 1-6 и
1-4 [88-90]. Согласно Шеферу, конформация Fi, определяемая по сродству
фермента к аналогам нуклеотидов, сильно зависит от Д|д,Н+. Следствием
этого является существование аналогов нуклеотидов, избирательно
блокирующих либо гидролиз, либо синтез. АТФ [91].
Существование медленных переходов фактора F] из активного в
неактивное состояние, индуцируемых АДф и нечувствительных к изменению
Д|д,Н+ (медленность изменений активности фермента сама по себе служит
сильным указанием на конформационные перестройки в молекуле белка [92])
открывает, на наш взгляд^ новую возможность обсуждения соотношений между
путями синтеза и гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой.
Три экспериментально обоснованных факта служат основной предпосылкой
нашей гипотезы. Во-первых, в присутствии второго субстрата окислительного
фосфорилирования - неорганического фосфата - величина константы
диссоциации медленного Fi-АДФ-комплекса соизмерима с величиной Кт для АДФ
в процессе окислительного фосфорилирования. Во-вторых, преинкубация
субмито-хондриальных частиц с АДФ блокирует АТФ-гидролазную реакцию и не
влияет на кинетику окислительного фосфорилирования. В-третьих, АТФ-
зависимая активация АДФ-блокированной АТФазы (последовательность реакций
5-7 малого цикла на схеме рис. 1) сама по себе должна представлять
АТФазную реакцию с числом оборотов 2 мин-1 (см. обсуждение механизма АТФ-
зави-симой активации выше). Такое число оборотов этой АТФазной реакции в
пересчете на величины активности составляет ~0,8 нмоль/мин на 1 мг белка
(содержание Fb определяемое по титру олигомицина в наших препаратах,
составляет ~0,4 нмоль/мин на
1 мг белка), или 0,01% от скорости АТФазной реакции, протекающей в
соответствии с последовательностью 1-3 большого цикла схемы рис. 1. Можно
представить, что обращение малого цикла и является последовательностью
реакций, происходящих при окислительном фосфорилировании, где
обнаруженный нами медленный комплекс Е-АДФ* служит фермент-субстратным
комплексом нормального каталитического цикла2. Сказанное может быть
2 Ситуация, очевидно, значительно сложнее, так как такой
упрощенный подход предсказывает, что максимальная активность АТФ-
зависимых эндергониче-ских реакций (обратный перенос, трансгидрогеназа)
должна быть меньше или равна 0,8 нМ/мин на 1 мг белка субмитохондриальных
частиц. Реальные величины примерно в 100 раз выше этого значения; это,
конечно, требует модификации простейшей схемы, приведенной на рис. 1.
46
иллюстрировано схемой, изображенной на рис. 2, в соответствии с которой
существуют две конформации фактора Fi - "гидро-лазная" и "синтетазная", а
равновесие между ними контролируется нуклеотидами - субстратом и
продуктом окислительного фос-форилирования (или АТФазной реакции).
Кинетически такая схема эквивалентна модели, представленной на рис. 1,
в которой пути синтеза и гидролиза АТФ различаются. Существование двух
форм фермента, катализирующих одну и ту же реакцию с различными
кинетическими параметрами, на первый взгляд должно было бы привести к
аномальной, не михаэли-совской кинетике гидролиза АТФ препаратами
субмитохондриаль-ных частиц, что экспериментально не наблюдается [50].
Кажущееся противоречие, по-видимому, объясняется чрезвычайно низкой
АТФазной активностью малого цикла (см. выше), и гидролиз АТФ,
максимальная скорость которого составляет лишь доли процента от общей
скорости гидролиза, не вносит ощутимого вклада в измеряемые кинетические
параметры.
Наиболее существенное следствие предложенной нами модели состоит в
том, что понимание механизма окислительного фосфори-лирования требует
детального изучения реакций малого цикла, а не большого. Следует
подчеркнуть, что в настоящее время количество экспериментальных работ по
изучению кинетики АТФазной реакции необозримо (см. [56-60]), тогда как
кинетике реакций, непосредственно связанных с синтезом АТФ, посвящены
лишь единичные работы ;[74, 79, 80]. По-видимому, это связано, во-первых,
с экспериментальными трудностями изучения кинетики окислительного
фосфорилирования, а во-вторых, с тем, что необычные эффекты АДФ до самого
