Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
отразиться и на процесс окислительного фосфорилирования. С другой
стороны, если АДФ-специфичный центр "регулирования" АТФазной активности
представляет собой активный центр АТФ-синтетазы, начальные скорости
процесса окислительного фосфорилирования будут одинаковыми в обоих
случаях: когда реакция начинается внесением свободного фермента или
фермент-субстратного комплекса. Для выбора между этими возможностями мы
сравнили кинетику АТФазной и АТФ-синтетазной реакций, катализируемых
субмитохондриальными частицами. Оказалось, что в условиях, когда гидролиз
АТФ происходит с отчетливым лаг-периодом, индуцированным АДФ (измерение с
АТФ-регенерирующей системой), скорость окислительного фосфорилирования
(измерение с АДФ-регенерирующей системой) постоянна во времени. Другими
словами, АТФ-синтетазный комплекс, АТФазная активность которого полностью
блокирована АДФ, способен катализировать реакцию окислительного
фосфорилирования. Ясно, что оба направления реакции нельзя измерить в
строго одинаковых условиях: их идентичность может соблюдаться с точностью
до нуклеотида - субстрата. В связи с этим для исключения эффектов
нуклеотидов на возможные Др Независимые изменения сродства Fi к лигандам
начальные скорости обоих процессов были измерены при различных
концентрациях АДФ (окислительное фосфорилирование) и АТФ (АТФазная
реакция). При этом различия в кинетике обоих процессов, катализируемых
препаратами, преинкубированными с АДФ, сохранились. Таким образом, АДФ
можно рассматривать как ингибитор фермента с однонаправленным (по
отношению к направлению реакции) действием.
Анализ кинетики АТФазной реакции и механизм действия некоторых
ингибиторов и активаторов АТФазы [51, 52]
Крайне высокое сродство АДФ к митохондриальной АТФазе и АТФ-зависимая
активация фермента приводят к тому, что постоянная скорость гидролиза АТФ
во времени в присутствии АТФ-регенерирующей системы различными
препаратами субмито-хондриальных частиц скорее исключение, чем правило.
Это, по-
2*
35
видимому, обусловлено различным содержанием АДФ, а следовательно,
деактивированного Fi в различных препаратах частиц. Кинетическое
поведение митохондриальной АТФазы может быть унифицировано их
"активацией" смесью содержащей фосфоенол-пируват и пируваткиназу. После
такой обработки (~30 мин, 25°С, напомним, что константа скорости АТФ-
независимой активации равна 0,2 мин-1) субмитохондриальные частицы или
растворимый фактор Fi катализирует гидролиз АТФ в присутствии АТФ-
регенирующей системы двухфазно: быстрая начальная фаза катализа сменяется
более медленной. Следующие параметры кинетики нуклеозидтрифосфатазной
активности оказались существенными для дальнейшего анализа. Двухфазность
наблюдается только при гидролизе АТФ; другие нуклеозидтрифосфаты
гидролизуются ферментом с постоянной скоростью. Уместно напомнить, что
только АДФ обладает способностью образовывать "медленный" комплекс с
АТФазой. Скорость перехода от первой ко второй медленной фазе гидролиза
прямо пропорциональна скорости реакции, вариации которой достигаются
использованием различных концентраций АТФ. Активация фермента обработкой
пируватки-назой или его торможение в ходе гидролиза АТФ неконкурентны по
отношению к АТФ: изменение каталитической активности сопровождается
только изменением Vmax при постоянном значении Кт для АТФ. Ни скорость
перехода от быстрой фазы к медленной, ни соотношение между активностями
фермента в первой и второй фазах реакции не зависят от количества
пируваткиназы и фосфоенолпирувата, использующихся в АТФ-регенерирующей
системе.
Простейшая схема, хорошо соответствующая такому набору
экспериментальных данных, может быть представлена в виде
±АТФЗ ±Ф" -АДФ
Е*-------->Е-АТФ*.____АДФ "_________ > Е. (11)
медленно
Е*. АДФ*
Схема (11) описывает обычную ферментативную реакцию, один из фермент-
субстратных комплексов которой подвергается медленной изомеризации с
образованием неактивного фермента. Сопоставление перечисленных выше
параметров двухфазности гидролиза АТФ со свойствами "медленного"
комплекса, образующегося при преинкубации АТФазы с низкими концентрациями
АДФ, дает достаточные основания полагать, что неактивный комплекс Е-АДФ*,
образующийся в результате изомеризации (схема 11), и неактивный Е-АДФ
комплекс идентичны.
Из приведенной выше схемы следует, что должны существовать эффекторы,
по-разному влияющие на две фазы гидролиза АТФ* это казалось особенно
вероятным для тех модуляторов АТФазы.
36
влияние которых проявляется медленно и (или) конечный результат их
действия зависит от природы гидролизующегося нуклеотида. Действительно,
нам удалось показать, что влияние азида - ингибитора АТФазы [69-71] и
сульфита - ее активатора [72, 73] опосредуется АДФ. Оказалось, что ни
азид, ни сильфит не влияют на начальную стадию гидролиза АТФ, будучи
