Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
фермент, блокированный АДФ в присутствии Фн. Последнее обстоятельство
заслуживает краткого обсуждения. В одной из последних публикаций Бойера
[81] в противоположность'ранее развиваемой им точки зрения [82] о
регуляторном характере обнаруженного нами торможения АТФазы АДФ приведена
схема, согласно которой "медленный" комплекс Е-АДФ рассматривается как
результат "неправильного" отщепления фосфата из тройного комплекса, где
АДФ связан в активном центре АТФазы (или АТФ-синтетазы):
Из схемы следует, что неорганический фосфат в стационарном состоянии
должен стимулировать АТФазную реакцию, что противоречит нашим результатам
[54]. Кроме того, если вслед за Бойером
описанном нами центре с высоким сродством, то даже в присутствии фосфата
число оборотов АТФазы не может быть больше 2 мин-1 (см. с. ООО).
Последнее явно противоречит фактам.
АДФ-Е*-
+АДФ
I
-Фн
.АДФ
Е- Ф"'
АТф
АДф-Е*вАТф А Тф -зависимая +Н20
мелленная
каталитический
цикл
(16)
активация
АДф*Е*АТф
-АДФ
Е-АТф
¦АДФ
принять, что АДФ в тройном комплексе Е
локализован в
•Ф
Н
39
"Полная" модель кинетики гидролиза АТФ митохондриальной
АТФазой и проблема обратимости гидролиза/синтеза АТФ
Суммированные в предыдущем разделе экспериментальные данные могут быть
описаны минимальной кинетической схемой, представленной на рис. 1. Прежде
чем обсуждать эту схему, целесообразно еще раз кратко повторить основные
экспериментальные факты, послужившие предпосылками ее построения. Левый,
больший цикл описывает простейшую последовательность реакций гидролиза
АТФ. Существование последовательности реакций правого, малого цикла 5, 6,
7 следует из кинетики АТФ-зависимой активации
АДф ин(tm)6итоР
Рис. 1. Кинетическая схема гидролиза АТФ митохондриальной АТФазой.
Прямыми стрелками показаны предполагаемые места действия ингибиторов и
активаторов фермента. Подробное объяснение в тексте
АТФазы, заторможенной после преинкубации с низкими концентрациями АДФ.
Связь между двумя циклами осуществляется реакцией 4, описывающей
медленную изомеризацию фермент-продукт-ного комплекса Е-АДФ в комплекс
Е*-АДФ, где АДФ связан в центре, отличном от того, где связывается АТФ
при гидролизе последнего (см. схему (II)). Превращение комплекса Е-АДФ в
Е*-АДФ за счет изомеризации (или транслокации) нуклеотида из одного
центра в другой без появления в растворе следует из зависящего от времени
торможения освобожденной от АДФ АТФазы при гидролизе АТФ (но не других
нуклеотидов) и отсутствия зависимости этого торможения от количества
добавленной пируваткиназы.
Действие сульфита, по-видимому, обусловлено предотвращением реакции 4.
Азид предотвращает АТФ-зависимую активацию АТФазы, блокированной АДФ;
таким образом, его влияние направлено на одну из стадий: 5, 6, 7. По ряду
соображений нам кажется наиболее вероятным, что азид предотвращает
диссоциацию АДФ из тройного неактивного комплекса АДФ-Е*-АДФ.
Полное выражение для скорости гидролиза АТФ. в реакции, описываемой
этой моделью, достаточно громоздко. Однако без
40
искажения сути модель может быть заменена более простой, эквивалентной:
Схема (17) сохраняет все основные свойства более детализированной модели
(рис. 1). Согласно этой упрощенной схеме фермент-субстратный комплекс
одностадийной реакции (Е-S) претерпевает необратимую изомеризацию
(напомним, что константа диссоциации комплекса Е*-АДФ очень мала,
~10~8М). Неактивный комплекс -Е-S может быть активирован субстратом через
стадию образования тройного комплекса S-E-S (АТФ-зависимая активация АДФ-
блокированного фермента). В присутствии избытка пируват-киназы стадии,
описываемые константами скоростей k2 и k5, необратимы. Сравним теперь
кинетику АТФазной реакции, катализируемой "активированной" АТФазой,
полностью освобожденной от АДФ и регистрируемой по начальным скоростям
реакции (малый цикл - рис. 1 - не функционирует), с кинетикой реакции в
стационарном состоянии, когда функционируют оба цикла.
В первом случае ("активированная" АТФаза, начальные скорости) :
w = ?a[E-S] (18)
и
fe2-E0-S
И + "IS
где tfs=AL±X (19)
Для стационарного состояния (функционируют оба цикла, измеряются скорости
после установления медленного равновесия между комплексами E-S, Е-S* и S-
E-S):
v = k2- [Е-S] +?5[S-E-S]. (20)
Членом &5[S-E-S] в выражении (19) можно пренебречь, так как k5 примерно
на четыре порядка меньше, чем k2. Другими словами, можно считать, что
