Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
фосфата. Впервые это представление было сформулировано Ларди и Уэлманом
применительно к интактным митохондриям [28] и с тех пор в явном или
неявном виде оно используется при анализе АТФазных реакций,
катализируемых различными митохондриальными препаратами; следует, однако,
отметить, что альтернативные точки зрения время от времени предлагались
различными авторами [29-33].
В последние годы из нескольких лабораторий появились сообщения о
"релаксационном" поведении р1-АТФазы.Д34-43]. Под*
29
I
релаксационным, или "гистерезисным", поведением понимают медленные во
времени (на порядок и более меньшие, чем время, необходимое для одного
оборота в каталитическом акте) изменения активности фермента. Значимость
экспериментально наблюдаемого релаксационного поведения Fi-АТФазы in vivo
в настоящее время неизвестна. В то же время сам факт его существования
вносит существенные особенности в трактовку кинетических экспериментов,
направленных на изучение механизма реакций синтеза л гидролиза АТФ.
Несколько лет назад в нашей группе было обнаружено, что АДФ -
субстрат окислительного фосфорилирования - вызывает необычное торможение
АТФазной активности, по ряду параметров принципиально отлйчающееся от
обычного конкурентного тормо-^ жения [46, 47] и по всем параметрам
соответствующее понятию о гистерезисных явлениях в энзимологии [44, 45].
Детальное изучение взаимодействия митохондриальной АТФазы с АДФ было
предметом исследования нашей группы в течение последних четырех лет.
Результаты этих работ опубликованы [48-55] и были доложены на нескольких
конференциях.
В объеме обычных журнальных публикаций, посвященных
экспериментальным исследованиям, не принято обсуждать более общие, чем
это вытекает из конкретных результатов, положения. Цель настоящего очерка
- кратко суммировать наши опубликованные результаты и дать более или
менее развернутое обсуждение вытекающих из них рабочих гипотез, проверка
которых, по нашему мнению, полезна для понимания механизма окислительного
фосфорилирования. Основные сведения об АТФазной реакции, необходимые для
такого обсуждения в очень краткой форме, даны выше. Более детальную
информацию о митохондриальной АТФазе читатель может найти в ряде
исчерпывающих обзоров '[56-60].
Взаимодействие АДФ и митохондриальной АТФазы
Торможение АТФазы низкими концентрациями АДФ [48, 49]. При измерении
АТФазной активности субмитохондриальных частиц, освобожденных от
белкового ингибитора (AS-частицы [61]), в системе, где происходит
накопление АДФ (регистрация реакции по изменению активности ионов
водорода '[62]:
АТФаза
АТФ-4 АДФ-3 + Фи + Н+), (2)
мы обнаружили, что при концентрации АТФ </Ст происходит быстрое (1-2
мин) торможение активности фермента. На первый взгляд такой результат не
удивителен, так как давно известно, что АДФ является конкурентным по
отношению к АТФ ингибитором АТФазы [46, 47]. В случае, если развивающееся
во времени торможение реакции было бы обусловлено убылью субстрата (АТФ)
и появлением конкурентного ингибитора (АДФ), следовало ожидать, что
повторное добавление фермента в количестве, равном
30
исходному, к системе, в которой начальная скорость реакции сильно
заторможена, вызовет в начальный момент времени удвоение скорости
гидролиза АТФ, так как скорость ферментативной реакции в присутствии
субстрата и конкурентного ингибитора прямо пропорциональна концентрации
фермента. Однако оказалось, что это не так. Повторное добавление AS-
частиц к реакционной смеси приводило к резкой (значительно большей, чем
двукратной) активации гидролиза, и скорость реакции затем быстро
уменьшалась, как и после добавления первой порции фермента. Другими
словами, создавалось впечатление, что в среде измерение активности
происходит быстрая необратимая инактивация АТФазы.
Контрольные эксперименты показали, что ни неорганический фосфат, ни
увеличение концентрации Н+, ни убыль субстрата, ни преинкубация фермента
в течение времени измерения не приводят к торможению АТФазной активности
AS-частиц. На основании этих простых опытов мы предположили, что АДФ
"необратимо" тормозит АТФазу. Для подтверждения этого предположения мы
воспользовались следующим приемом. Субмитохондриальные частицы
преинкубировали с АДФ и определяли их начальную АТФаз-ную активность в
системе, которая обеспечивает необратимое удаление АДФ, образующейся в
ходе реакции
лактатде-
АТФаза АТФ гидроген аза
АТФ---------*¦ АДФ---------" пируват-----------" лактат (3)
-Ф -1-фосфоенол- НАД-Н
пируват
при большом избытке пируваткиназы, лактатдегидрогеназы и их субстратов.
Такая система обеспечивает постоянный уровень АТФ, а скорость ее
