Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
гидролиза легко прослеживается по изменению концент-¦ рации НАД-Н [63].
Оказалось, что в этой системе при измерении активности фермента,
преинкубированного с АДФ, наблюдается отчетливая лаг-фаза в образовании
продуктов реакции: другими словами, скорость диссоциации АДФ из
неактивного Е-АДФ-комп-лекса достаточно низка для того, чтобы ее можно
было измерить обычными методами. По величинам начальных скоростей
реакций, катализируемых препаратами, преинкубированными с различными
концентрациями АДФ, легко определить константу диссоциации фермент-
ингибиторного комплекса; она оказалась равной
2-10-8 М1. В дальнейшем было показано, что аналогичная картина
наблюдается и при использовании растворимого фактора Fi. Влияние АДФ
специфично: преинкубация АТФазы с другими нуклео-зиддифосфатами (ГДФ,
ИТФ), .взятыми как в низких, так и в высоких концентрациях, не влияет на
кинетику гидролиза АТФ. Гидролиз других нуклеозидтрифосфатов (ГТФ, ИТФ)
после пре-инкубации фермента с АДФ оказывается заторможенным, подобно
*
1 При расчете константы диссоциации использовано уравнение для
системы, с взаимным истощением [64].
31
тому, как это происходит при использовании АТФ в качестве субстрата.
Торможение реакции, индуцированное АДФ, требует ионов Mg+2 или других
двухвалентных металлов.
АТФ-зависимая активация АДФ-блокированного фермента [48, 60]. Как
было отмечено выше, если АТФазная реакция начинается добавлением
фермента, преинкубированного с АДФ, к системе, содержащей АТФ и АТФ-
регенерирующую систему, наблюдается лаг-фаза, а конечная скорость реакции
спустя некоторое время достигает контрольных величин. Это означает, что
диссоциация комплекса Е • АДФ происходит значительно медленнее, чем
реакция, катализируемая свободным от ингибитора ферментом. Возможны два
принципиально различных механизма активации фермента:
-АДФ ±АТФ
Е-АДФ "---------> Е *------------> . ?АТФ • (4)
(фермент- медленно (свободный быстро (интермедиат
ннгибиторный фермент) АТФазной реакции)
комплекс) k
АТФ АДФ
Е • АДФ"------------ АТФ-Е-АДФ"---------- Е-АТФ .
(5)
быстро медленно (интермедиат
(тройной , АТФазной реакции)
K_f-i/K_x комплекс)
В соответствии с моделью (4) АТФ способна образовывать фер-мент-
субстратный комплекс только после диссоциации ингибитора (АДФ). В случае
(5) АТФ взаимодействует с фермент-ингибитор-бым комплексом, в результате
чгго происходит отщепление ингибитора с образованием активного
интермедиата АТФазной реакции. Следует подчеркнуть, что если первая схема
требует участия в процессе активации единственного места связывания для
нуклеотида (фермент связывает либо АДФ, либо АТФ), то для •осуществления
реакции (5) необходимо существование по крайней мере двух мест связывания
нуклеотидов молекулой фермента. Как было отмечено выше, структурных
ограничений для рассмотрения обеих возможностей не существует (Fi
способен связывать до 6 нуклеотидов на молекулу" фермента). Схемы (4) и
(5) можно различить кинетически, по зависимости кажущейся константы
скорости активации фермента (Анаб) от концентрации АТФ.
В первом случае
- AHa6 = Ai
(6)
и не зависит от АТФ.
Во втором
и ____ fe-2 ¦ [АТФ]
наб ~ [АТФ]+Какт ' v
где какт =
*+i
32
Сравнение выражений (6) и (7) показывает, что, если активация фермента
происходит по механизму (7), следует ожидать зависимости скорости
активации от концентрации АТФ согласно уравнению Михаэлиса.
Экспериментальные результаты показали, что на самом деле скорость
активации гиперболически зависит от концентрации АТФ; значение константы
скорости первого порядка для распада тройного комплекса (насыщающие
концентрации АТФ) равно 2 мин-1 (25° С), а величина /Сакт-ЫО-1 М и
совпадает со значением константы Михаэлиса, измеренной в тех же условиях,
что для АТФазной реакции. Сказанное дает основание полагать, что: 1) при
образовании Е-АДФ-комплекса ингибитор не связан в центре фермента, из
которого АДФ отщепляется в ходе гидролиза АТФ (если бы это было так, то
число оборотов АТФазы было бы 2 мин-1, тогда как реальные величины имеют
порядок ЫО4 мин-1); 2) АТФ связывается с одним и тем же центром фермента
в ходе как каталитического акта, так и активации фермент-ингибиторного
комплекса.
Величина "спонтанной", АТФ-независимой константы скорости активации
фермента была определена следующим образом. Фермент блокировали АДФ
(концентрации Е и АДФ подбирали таким образом, чтобы в системе
