Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
ингибитором и активатором (соответственно) второй стадии реакции. Более
того, скорость торможения АТФазы азидом, как и скорость перехода реакции
во вторую, медленную фазу, прямо пропорциональна начальной скорости
реакции. Сульфит предотвращает переход к медленной фазе реакции, когда он
добавлен к среде раньше фермента, и активирует реакцию во второй ее фазе,
или на фоне торможения азидом. Ни тот, ни другой эффекторы не влияют на
скорость гидролиза ИТФ, а кинетический механизм их ингибирующего' (азид)
и активирующего (сульфит) влияния на гидролиз АТФ неконкурентен по
отношению к АТФ.
Принимая во внимание схему (11) и перечисленные выше факты, легко
описать формальный механизм действия азида и сульфита:
±атф -ф" -АДФ
Е --------*-Е - АТФ-------> Е• АДФ--------> Е
сульфит- ^
± азид
Е* • АДФ*--------- Е* ¦ АДФ
азид
Как видно из схемы, оба эффектора не влияют на собственно АТФазную
реакцию, а их действие связано с реакциями, приводящими к изомеризации
"быстрого" Е-АДФ-комплекса в "медленный" (Е*-АДФ).
В подтверждение предложенной схемы мы показали, что сульфит
предотвращает торможение АТФазы, вызванное преинкуба-цией фермента с
низкими концентрациями АДФ, а азид блокирует активацию АТФазы
фосфоенолпируватом и пируваткиназой.
Взаимодействие неорганического фосфата и митохондриальной
АТФазы [54]
Поскольку неорганический фосфат является субстратом окислительного
фосфорилирования, можно думать, что Fi имеет специфический центр его
связывания. Действительно, растворимая АТФаза может связывать фосфат [6-
8]с Кдис, соизмеримым со значениями Кт Для этого субстрата в процессе
окислительного фосфорилирования [74]. Если фосфотрансферазные реакции,
происходящие при гидролизе АТФ, катализируемом растворимым Fi или
субмитохондриальными частицами, рассматривать как про-
37
цесс, обратный окислительному фосфорилированию, протекающий по пути либо
1, 2, 3, 4, либо 1, 2, 5, 6 (либо по обоим), и реакции 3 или 6 обратимы,
то неорганический фосфат должен быть ингибитором АТФазной реакции.
Однако это не так: фактически фосфат активирует АТФазную реакцию [75-77],
а его влияние на АТФ-зависимые эндергониче-ские реакции
субмитохондриальных частиц сложное и зависит от присутствия АДФ [78].
Такое парадоксальное влияние фосфата на АТФазную активность послужило
предпосылкой для наших исследований, в которых было обнаружено сильное
воздействие Фн на образование "медленного" комплекса Е-АДФ. Мы показали,
что неорганический фосфат практически не влияет ни на Кт для АТФ, ни на
Ki для АДФ (простой конкурентный тип торможения) в АТФазной реакции,
катализируемой субмитохондриаль-ными частицами. В то же время величина
константы диссоциации медленного комплекса Е-АДФ в присутствии 10 мМ Фн
увеличивается на два порядка. Следует отметить, что предложенная нами
ранее гипотеза, согласно которой высокоспецифичное к АДФ место связывания
нуклеотида служит активным центром АТФазной реакции [50, 53],
количественно плохо согласовывалось с величинами Кт для АДФ в процессе
окислительного фосфорилирования. Сильное уменьшение сродства фермента к
АДФ в присутствии фосфата, во-первых, сняло это противоречие, а во-
вторых; позволило дать простую интерпретацию ряду ранее известных, но не
объясненных фактов. Давно известно, что азид, будучи ингибитором АТФазы,
ингибирует связывание фосфата фактором Fb а сульфит увеличивает это
связывание {7]. Образование комплекса Fi с фосфатом - медленный процесс
[6, 7], что плохо соответствует представлению о его вовлечении в
каталитический цикл окислительного фосфорилирования. Оба этих явления
логически вытекают из схемы (12), так же как и не объясненная ранее
стимуляция АТФазной реакции после преинкубации с неорганическим фосфатом
[75-77]. Нам удалось показать, что неорганический фосфат, уменьшая
сродство АТФазы к АДФ, медленно (с такой же скоростью, как и АТФ-
регенерирующая система) активирует АДФ-блокированную АТФазу, и эта
активация чувствительна к азиду.
К сожалению, из-за методических трудностей мы не можем различить два
возможных варианта взаимозависимого связывания АДФ и ФцС митохондриальной
АТФазой:
Е-АДФ
(13)
Е'Фн
38
±АДФ ±фи
Е-АДФ-------- Е"------"Е-ФН ;
(И)
±Ф" к3
к4 ±Ф"
(15)
где Ki<K4 и Кз<К4- Первый вариант (14) соответствует конкуренции между
АДФ и Фн за общее место связывания, а второй (15) - отрицательной
кооперативности между связыванием АДФ и Фв. Решение этой альтернативы
позволило бы пролить свет на кинетический механизм окислительного
фосфорилирования [79, 80] (см. альтернативные пути на схеме (13)). Важно
подчеркнуть, что АТФаза, блокированная относительно высокими
концентрациями АДФ в присутствии Фн также медленно активируется, как и
