Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
практически не оставалось ни свободного фермента, ни свободного
ингибитора, что легко достижимо, так как константа диссоциации равна 2-
10_8М), добавляли большой избыток пируваткиназы и фосфоенолпирувата и во
времени определяли появляющуюся по ходу инкубации АТФазную активность
(начальные скорости реакции). Определяемая таким образом константа
первого порядка скорости диссоциации Е-АДФ комплекса оказалась равной -
0,2 мин-1, т. е. на порядок меньше, чем константа скорости диссоциации
тройного комплекса АТФ-Е-АДФ (2 мин-1). Другими словами, связывание АТФ в
активном центре АТФазы вызывает 10-кратное ускорение диссоциации АДФ из
центра, где последний связывается с высоким сродством.
Для анализа событий, происходящих при диссоциации АДФ из тройного
комплекса, воспользуемся следующей схемой:
(1) ± АТФ
-Е- +---------->?-АТФ
(3) ± ЛДФ
к,
к.
АДФ • Е ¦
к,
(4)
АДФ
(8)
ьатф<2>
АДФ-?-АТФ
Существование реакции (/) следует из сродства фермента к АТФ при
гидролизе последнего (Ki = 10-4 М), реакции (3) - из экспериментально
наблюдаемого образования комплекса фермента с АДФ, где последний связан в
центре, отличном от ката-
2 Заказ 423
33
литического, реакций (2) и (4) - из кинетики АТФ-зависимой активации
АТФазы, блокированной АДФ. Как было указано, Ki = K2 (связывание АДФ не
влияет на сродство фермента к АТФ, хотя и блокирует его гидролиз); в силу
замкнутости цикла (8) это означает, что Кз = К4 или, другими словами,
сродство АДФ к ферменту не зависит от присутствия АТФ в каталитическом
центре. Экспериментально, однако, показано, что константа скорости
диссоциации АДФ из тройного комплекса, входящая в К4 (?-4). на порядок
больше таковой для комплекса Е-АДф и входящей в Кз (?-з) - Условие Кз=К4
может, таким образом, сохраняться только, если предположить, что
связывание АТФ увеличивает константы скоростей связывания и отщепления
АДФ в одно и то же число раз:
К3 = К4; *-4= ЮЛ-,. (9)
k-3 ?-4]
Следовательно, должно быть равно 10 k3. Величина кз, рассчитанная нами с
использованием экспериментально определенных Ка и ft-з, равна 107-М-1
мин-1 [50], т. е. близка к верхнему пределу констант скоростей
образования специфических комплексов фермента с лигандами {65,66].
Поэтому предположение об увеличении скорости связывания АДФ под действием
АТФ мало вероятно. Гораздо более естественной кажется возможность,
согласно которой ускорение диссоциации АДФ, вызванное АТФ, обусловлено
медленным гидролизом АТФ в активном центре фермента. АТФ-за-висимая
активация АДФ-блокированной АТФазы тогда может быть представлена
следующей схемой:
-f АТФ _Фи -АДф
АДФ - Е *-------* АДФ • Е • АТФ <----- - АДФ ¦ Е ¦ АДФ -------
быстро медленно быстро
(k=2 мин-1)
?¦ АДФ. (10)
(интермедиат
АТФазной
реакции)
Подтверждением (но не доказательством!) такого механизма служат
экспериментальные наблюдения, согласно которым скорость активации
фермента, преинкубированного в присутствии высоких концентраций АДФ
(условия образования комплекса АДФ-Е-АДФ, схема 10), значительно больше,
чем скорость этого-процесса для комплекса Е-АДФ. В нашей первой
публикации это явление было представлено в виде снятия тормозящего
эффекта, низких концентраций АДф высокими (см. рис. 3 в работе [48]),
однако более детальное, хотя и недостаточное для публикации исследование
этого явления показало, что кажущаяся активация фермента высокими
концентрациями АДФ обусловлена лишь резким увеличением скорости его
активации; начальная скорость гидролиза АТФ в обоих случаях равна нулю
[67].
АТФ-зависимая активация АДФ-блокированной мембранно-
34
связанной АТФазы, естественно, поднимает вопрос о возможном вовлечении
мембранного потенциала в этот процесс. Однако мы показали, что ни
искусственное сопряжение AS-частиц низкими концентрациями олигомицина
[68], ни добавление разобщителей не меняют кинетики активации фермента.
Влияние АДФ на окислительное фосфорилирдвание [53]. Изучение влияния
АДФ на АТФазную реакцию, катализируемую митохондриальным АТФ-синтетазным
комплексом, представляет интерес главным образом потому, что АДФ -
субстрат окислительного фосфорилирования. Можно предположить, что, если
АДФ является аллостерическим эффектором фермента, блокирующим АТФазную
реакцию, насыщение АДФ-специфичного центра связывания лигандом должно
