Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
регуляторном центре А/-белка, ни на взаимодействие с N-белком, но
вызывает быстрое ингибирование аденилатциклазы, предварительно
активированной GppNHp [109]. В гибридных клетках NG 108-15 2'-
дезоксиаденозин также быстро ингибирует аденилатциклазу в мембранах,
предварительно обработанных GppNHp, однако эффект аналога аденозина
обратим и активация фермента полностью восстанавливается после удаления
нуклеози-да из мембран отмывкой [153]. Вышеперечисленные данные могут
свидетельствовать в пользу расположения P-участка на каталитическом
белке, однако прямо это не показано. Ингибирующий эффект аналогов
аденозина может заключаться в том, что они препятствуют реализации
активирующего действия N-белка на уровне его взаимодействия с
каталитическим белком или на уровне активации каталитического белка.
Следует также отметить, что ингибирование аденилатциклазы через P-участок
контролируется ионами Mg2+ и Мп2+ [149, 150, 152].
Физические свойства каталитического белка аденилатциклазы практически
не- изучены. Причиной отсутствия информации являются существенные потери
каталитического белка, не связанного с N-белком, происходящие в процессе
его очистки в результате инактивации [61]. Наиболее правильное
представление о характеристиках каталитического белка можно получить,
изучая биологические препараты, функционально лишенные N-белка. К ним
относятся линия клеток лимфомы S49, сус~ [115, 123], цитозольные фракции
семенников крыс [22, 47], а также растворимые аденилатциклазы низших
организмов [43-45]. Как уже упоминалось выше, общим свойством для этих
белков является сильное увеличение активности в присутствии ионов Мп2+,
но не Mg2+. Определяется ли это обстоятельство свойствами связывающего
ионы двухвалентных металлов аллостерического центра или раз-
114
личием в сродстве к активному центру Mg-АТФ2- и Мп-АТФ2-, не известно. В
случае клеток сус~ было, например, показано, что Кт для обоих субстратов
одинакова и составляет 0,1-0,2 мМ [148]. В луброльных экстрактах
плазматических мембран клеток сус~ Мп2+-зависимая активность
аденилатциклазы чувствительна к некоторым протеазам и сульфгидрильным
препаратам [115, 123].
Активный центр каталитического белка
Изучению активного центра аденилатциклазы посвящено относительно
небольшое количество работ. С одной стороны, это обстоятельство связано с
отсутствием методов получения стабильных гомогенных препаратов
каталитического белка из тканей млекопитающих. С другой стороны, слабое
развитие этого направления исследований в течение ряда лет определялось
общей направленностью усилий экспериментаторов на разрешение вопросов
регуляции аденилатциклазного комплекса.
В данном разделе будут обобщены разрозненные сведения, которые
позволяют сделать некоторые выводы о строении активного центра
аденилатциклазы.
Большинство из этих данных получено благодаря применению структурных
аналогов субстрата реакции - АТФ. Использование аналогов субстрата
расширяет методические возможности изучения механизмов каталитических
реакций негомогенных ферментов.
К альтернативным субстратам аденилатциклазы относятся: 2'-
дезоксиаденозин-5'-трифосфат [154, 155], аденилил-5'-имидоди-фосфат [72],
аденозин-5/-(Р3-тиотрифосфат) [156], аденозин-5'-(Р^тиотрифосфат) [157],
аденин-арабинонуклеозид-б'-трифосфат [158], туберцидин-5'-трифосфат [159]
и формицин-5'-трифосфат [159, 160]. При сравнении их структуры
обнаруживается, что субстратная специфичность ограничена, как правило,
адениновым основанием. На сродстве субстрата к ферменту не отражается
модификация пятичленного кольца гетероциклического основания в положениях
8 и 9, переводящая адениновое основание в фор-мициновое [160]. Слабое
ингибирование аденилатциклазы, свидетельствующее о низком сродстве к
активному центру пиримидинового кольца, показано для пиримидиновых
нуклеозид-5'-три-фосфатов (ТТФ, ЦТФ, <ЛТФ и УТФ) [161].
- Таким образом, важность вклада гетероциклического основания в сродство
АТФ к активному центру аденилатциклазы не подлежит сомнению. Однако
детерминанты этого сродства известны лишь приблизительно. Роль такой
детерминанты, возможно, выполняет аминогруппа аденина, расположенная в
положении 6. Возможно, что она отвечает за взаимодействие с сульфгидриль-
ной группой, о существовании которой свидетельствует чувствительность
каталитического компонента аденилатциклазы из клеток сусг к
сульфгидрильным ядам [115, 123].
Особый интерес представляет характеристика взаимодействия с ферментом
трифосфатного участка субстрата. Во-первых, этот
115
участок несет в себе группу, подвергающуюся нуклеофильной атаке во время
каталитического акта (а-фосфат), и одновременно лирофосфатную группу,
отщепляющуюся в результате катализируемой реакции. Во-вторых, именно с
поликатионным фосфатным участком связывается ион двухвалентного металла,
без которого яевозможна работа аденилатциклазы.
К настоящему времени изучено действие на аденилатциклазу нескольких
