Молекулярные основы действия ферментов - Севери Г.А.
Скачать (прямая ссылка):
нуклеотиды, фторидная активация в присутствии Mg2+ все равно происходит
[141]. Фторид не изменяет параметров связывания нуклеотидов в
регуляторном участке N-белка [127]. Однако гуаниловые нуклеотиды могут
модулировать величину фторидной активации, так как посадка ГМФ в
свободном нуклеотид-связывающем центре N-белка предотвращает ее [127]*
ГДФрБ также мешает фторидной стимуляции [127, 138] и возвращению
фторидной чувствительности мембранам клеток сус~ при реконструкции [126].
Однако другие нуклеотиды (ГДФ, ГТФ,. GppNHp) увеличивают фторидную
стимуляцию [127, 142]. Фторид способствует также ассоциации
оккупированного ГДФ N-белка с каталитическим [28, 118]. Таким образом, в
механизме активирующего действия фторида по-прежнему остается много
неясных моментов. На наш взгляд, особенно интересным является тот факт,
что в присутствии ГДФ фторид может переводить N-бе--ок в активированное
состояние, т. е. отсутствие уФ0СФата У вза_ имодействующего с N-белком
нуклеотида еще не является абсолютно ограничивающим активацию фактором.
\ Каталитический белок аденилатциклазного комплекса.
Строение его активного центра
Активация аденилатциклазы в ответ на гормональный сигнал происходит в
результате прочного белок-белкового взаимодействия N-белка с
каталитическим белком. В результате этого увеличивается максимальная
скорость ферментативной реакции. В отличие от медленных изменений N-белка
активация каталитического белка происходит быстро. Быструю и обратимую
активацию каталитического белка ' может осуществлять дитерпен форсколин,
выделяемый из корней Coleus forskohlii [143]. Эта активация не
опосредована через N-белок, кальмодулин или через рецептор, так как
осуществляется в мембранах клеток сусг и не ингибируется под действием
ЭГТА, p-блокаторов или ГДФр5. Форсколин не изменяет структуру мембраны,
так как активируется и растворимая аденилатциклаза из семенников крыс, и
солюбилизированная аденилатциклаза из мозга крысы. Причем в семенниках
крыс форсколин переводит каталитический белок из Мп2+-чувствительного в
М^2+-чувствительное состояние. Предполагают, что форсколин
взаимодействует непосредственно с каталитическим белком или с еще не
известным компонентом аденилатциклазного комплекса. Но не исключена
возможность модуляции активности и N-белка, так как некоторые гормоны
активируют аденилатциклазу сильнее-в присутствии форсколина [144].
Примером другого взаимодействия, приводящего к активации
каталитического белка, является его взаимодействие с кальмоду-лином. В
лаборатории Нира отделенный от А/-белка каталитический белок из мозга
активировался кальмодулином, и при реконструкции с N-белком кальмодулин
не влиял на скорость и величину активации аденилатциклазы под действием
GppNHp [145]. Независимость кальмодулиновой активации от ГТФ и
аддитивность ее с активацией аденилатциклазы под действием GppNHp-
показаны также на частично очищенной аденилатциклазе из мозга быка [146].
Кроме того, кальмодулин активирует нечувствительную к гуаниловым
нуклеотидам и не содержащую N-белка аденилатциклазу из Bordetelta
pertussis [147]. В настоящее время трудно сказать, какое физиологическое
значение может иметь стимуляция аденилатциклазы под действием
кальмодулина, которая, судя по аддитивности двух эффектов, может
осуществляться путем, отличным от механизма активации аденилатциклазы
гормонами.
Как было показано недавно [148], каталитический белок аденилатциклазы
из клеток сус- содержит аллостерический центр связывания двухвалентных
катионов, который имеет высокое сродство к Mn2+ (/Ст=0,3-0,7 мМ) и низкое
сродство к Mgz+ (Кт= = 2-6 мМ). Во время реконструкции с предварительно
активированным А/-белком из мембран эритроцитов индюка активация
каталитического белка существенно зависит от наличия в среде свободных
ионов Mg2+, т. е. определяется работой аллостерическо-
113:
го центра, скорее всего, расположенного на каталитическом белке и
идентичного аллостерическому центру, определяемому в отсутствие N-белка.
Не установлена роль так называемого P-участка, ответственного за
ингибирование аденилатциклазы аденозином и его аналогами [149]. P-участок
специфичен к пуриновому основанию и наи-•больший ингибирующий эффект дают
модифицированные по ри-бозе аналоги аденозина. P-участок легко отличить
от мембранносвязанного аденозинового рецептора, который активируется или
ингибируется меньшими концентрациями аденозина, специфичен jk рибозе и
ингибируется метилксантинами. Ингибирование аденилатциклазы через P-
участок обнаружено в подавляющем большинстве исследованных
аденилатциклазных систем [149]. Он отличен от активного центра
аденилатциклазы, так как 9-(тетрагид-ро-2-фурил)аденин [150, 151] и
2',5'-дидезоксиаденозин [151] и аденозин [152] ингибируют аденилатциклазу
неконкурентно по отношению к Mg2+-AT(r). Однако он не имеет отношения и к
N-белку. Об этом свидетельствуют данные, полученные на эритроцитах
индюка, где 2',5'-дидезоксиаденозин не влияет ни на обмен нуклеотидов в
