Кинетика биологических процессов - Рубин А.Б.
Скачать (прямая ссылка):
Ключевой стадией механизма катализа является связывание молекул субстрата с определенными группами атомов молекулы, фермента. В результате образуется активный комплекс, называе-
мый комплексом Михаэлиса. После соответствующей обработки молекулы субстрата — ее расщепления, перестановки или замены некоторых групп атомов — происходит разрыв связей, удерживающих молекулу продукта в комплексе с ферментом — комплекс распадается с освобождением продукта и регенерацией фермента.
Гипотеза об образовании фермент-субстратного комплекса в ходе ферментативного катализа, высказанная еще в 1902 г. в трудах Брауна и Анри, долгое время не находила прямого экспериментального подтверждения. Причиной тому были чрезвычайная лабильность промежуточных соединений ферментативных реакций и малые концентрации активных комплексов.
Впервые предположение о существовании активного комплекса фермент—субстрат было переведено на язык математической модели в 1913 г. Михаэлисом и Ментен с целью объяснения наблюдавшегося ими эффекта насыщения субстратом скорости ферментативной реакции (Michaelis, Menten, 1913).
В основу исходной модели Михаэлиса—Ментен была положена следующая схема процесса:
Ki
S + E^LES, (II.l— 1)
где S — субстрат, Е — фермент, ES — комплекс Михаэлиса,. k+i — константа, или абсолютная скорость образования активного комплекса (реакция второго порядка). Обратная стрелка с константой й_1 указывает на то, что реакция образования комплекса обратима. Позднее была учтена и реакция распада комплекса с образованием продукта, которую считали необратимой* что во многих случаях соответствует действительности. С учетом этой стадии для реакции (II.1—1) справедлива широкоизвестная формула стационарной скорости ферментативной реакции
у__КгЕ^_ (III— 2}
*m + S '
Здесь Ео — общая концентрация фермента, Кт = **---
*+i
так называемая константа Михаэлиса.
Основным следствием уравнения (II.1—2), полученного в 1925 г. Бриггсом и Холдейном, является эффект насыщения, послуживший отправной точкой при построении математической теории рассматриваемой реакции.
Справедливость соотношения (II.1—2) для многих реакций была подтверждена экспериментально. В этих экспериментах измеряли зависимость стационарной скорости реакции от концентрации субстрата. К настоящему времени получены прямые экспериментальные доказательства реальности существования фер-мент-субстратных комплексов. Так, ряду исследователей удалось непосредственно зарегистрировать образование активного ком-
плекса и проследить за изменениями его концентрации в ходе ферментативной реакции. Впервые такие исследования провел Чанс с помощью метода непрерывной спектрометрии (Chance, 1943). Двадцать лет спустя японским ученым Яги и Озава удалось получить стабильный в анаэробных условиях кристаллический комплекс фермента оксид азы Д-аминокислот с субстратом Д-аланином.
В ряде случаев теоретическая зависимость (II.1—2) с высокой степенью точности описывает кинетику ферментативных реакций, наблюдаемую в экспериментах. Зачастую, однако, экспериментальные кривые обнаруживают существенные расхождения с теоретическими. Это обусловлено существованием целого ряда физико-химических особенностей ферментов, сильно усложняющих простую кинетическую схему (II.1—1). Эти особенности необходимо учитывать при построении соответствующих математических моделей, поэтому остановимся кратко на некоторых из них.
Число и последовательность стадий реакции
Многие ферментативные реакции протекают в несколько стадий с образованием по меньшей мере двух или трех промежуточных соединений, возникающих в определенной последовательности:
E + S^lESz^EZ^EPz^E + P.
При этом все стадии такой последовательности могут быть обратимыми. (Если процесс распада активного фермент-субстратного комплекса с освобождением продукта является обратимым, то в реакции помимо комплекса ES образуется комплекс фермента с продуктом ЕР.)
Кроме того, в большинстве ферментативных реакций участвует более одного субстрата и образуется соответственно два или большее число продуктов. Часто среди ферментативных реакций встречаются двухсубстратные. К ним относятся, напрнмер, разнообразные реакции переноса, катализируемые трансферазами, а также реакции, протекающие с участием кофакторов (АТФ или НАД). Возможны и такие реакции, в которых принимает участие более двух субстратов.
Двухсубстратные реакции протекают с образованием по меньшей мере двух или трех фермент-субстратных комплексов, а именно ES 1 и ESiS2 или ESU ES2 и ESiS2. Простейшая схема реакции в. этом случае имеет вид:
E-l-S^ES^
ESX + ^ ?SjS 2 —
Однако при участии в реакции двух субстратов последовательность стадий может быть и более сложной, например:
E + S^ES^ES],
