Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Варианты системы Y2H. Разработан ряд вариантов основной дрожжевой дигибридной системы, использующихся для отбора мутантных белков, взаимодействие между которыми нарушается в результате мутаций. В системе, получившей название обратной Y2H, для отбора белков с нарушенным взаимодействием применяют Gal4 DBD и AD, а также ген-репортер URA3 в качестве контр-селектируемого маркера (рис. 50, а). В такой системе вначале подтверждают взаимодействие между исследуемыми белками, выращивая клетки в отсутствие урацила, а затем отбор веществ, нарушающих взаимодействие между белками, проводят в присутствии 5-FOA. Клетки выживают лишь в том случае, если исследуемые белки в результате внешнего воздействия перестают взаимодействовать друг с другом, и экспрессия гена URA3 прекращается.
В разделенной гибридной системе (split-hybrid system) обнаружение белок-белковых взаимодействий проводят с использованием двух генов-репортеров (рис. 50, б) [128]. В этой системе взаимодействие белков друг с другом активирует транскрипцию гена tet Е. coli, который кодирует репрессор TetR, взаимодействующий с ДНК. Экспрессия гена HIS3 находится под контролем двух тандемных операторов. Первоначально исследуемое белок-белковое взаимодействие активирует ген tet, а образующийся репрессор TetR блокирует транскрипцию гена HIS3, что делает невозможным рост клеток в отсутствие His в питательной среде. Нарушение белок-белкового взаимодействия приводит к обратному эффекту, что позволяет проводить отбор соответствующих ингибиторов по росту клеток в отсутствие аминокислоты.
Система с репрессируемым трансактиватором (repressed transactivator system - RTS) является еще одной разновидностью системы Gal4 Y2H, в которой AD-домен Gal4 заменен на N-концевой репрессорный домен RD дрожжевого белка-репрессора TUP1 [129,130] (рис. 50, в). В такой системе ген-репортер URA3 находится под контролем промотора гена GAL1. В отсутствие взаимодействия между исследуемыми белками ген URA3 активирован, и, следовательно, дрожжевые клетки погибают в присутствии 5-FOA. Если же домены Gal4-DBD и TUP1-RD, находящиеся в составе гибридных белков, сближаются друг с другом благо-
даря взаимодействию исследуемых участков их полипептидных цепей, то RD-домен подавляет транскрипцию гена URA3 с промотора GAL1, и клетки становятся устойчивыми к 5-FOA.
Системы Y2H, не требующие активации или подавления транскрипции. Использование синтеза РНК для обнаружения взаимодействия белков друг с другом является с биохимической точки зрения очень сложным подходом. Его реализация требует переноса гибридных белков в ядро с последующим влиянием на аппарат транскрипции, что открывает большой простор для артефактов, часть которых была отмечена выше. В этой связи, усилия исследователей направлены на создание дигибридных систем, не зависящих от транскрипции генов-репортеров. Некоторые из таких систем основаны на появлении новой ферментативной активности после объединения двух гибридных белков, каждый из которых сам по себе ею не обладает. Один из вариантов дигибридных систем основан на обнаружении активности дигид-рофолатредуктазы, которая появляется в результате объединения двух фрагментов полипептидной цепи данного фермента, что является одной из разновидностей генетической комплементации [131]. У дигидрофолатредуктазы N-концевой и С-концевой домены (1-105 и 106-186 а.о., соответственно) не приобретают правильной пространственной конформации, не объединившись друг с другом. На этом основании их ассоциацию обнаруживают по появлению ферментативной активности или способности взаимодействовать с конъюгатом ингибитора метотрексата с флуоресцеином. Описаны системы и на основе зеленого флуоресцирующего белка (GFP) [70].
Проблема ложноположительных и ложноотрицательных результатов при использовании системы Y2H. Ложноположительные результаты, в которых желаемое выступает под видом действительного, являются неизменными спутниками любой научно-исследовательской работы, в том числе, и систем отбора белков in vivo. По механизму возникновения ложноположительные результаты можно разделить на две категории: технические и биологические [132]. К первой группе относятся артефакты, не связанные со взаимодействием двух гибридных белков как таковым. В этом случае экспрессия некоторых гибридных белков сопровождается необъяснимой индукцией гена-репортера. Такие технические проблемы можно минимизировать, используя, например, несколько респонсивных промоторов для гена-репортера [133]. Ложноположительные результаты биологической природы являются следствием взаимодействия между исследуемыми белками, которого не происходит в клетке. Доля таких взаимо-
действий, которую можно оценить путем анализа данных, полученных с известными белками или по глобальным профилям экспрессии двух генов, кодирующих анализируемые белки, составляет 40-50% [133, 134].
Возникновение ложноположительных клонов особенно вероятно в первых раундах отбора белков, эволюционирующих in vitro, когда их активность еще слабо выражена, и для ее обнаружения приходится использовать высокочувствительные гены-репортеры. Часто клетки, выжившие во время такого отбора, не содержат белков, взаимодействующих друг с другом, а являются мутантами, которые обладают искомым фенотипом. Помимо этого, найдется множество других причин, по которым могут вырасти фоновые колонии клеток дрожжей. Подробное описание подходов и конкретных методов, с помощью которых можно снизить влияние ложноположительных клонов на общий исход эксперимента, можно найти в специальных руководствах [132]. Здесь же отметим, что для успешного решения задач по отбору белков в ходе направленной эволюции, необходимо на основании данных литературы выбрать формат оптимальной системы Y2H, в котором соблюден баланс между чувствительностью системы и ее устойчивостью к посторонним шумам. Выводы о взаимодействии белков друг с другом можно делать лишь по степени воспроизводимости результатов с несколькими генами-репортерами. Положительные клоны, полученные при первичном скрининге, должны исследоваться в новом раунде отбора. При этом во вторичном скрининге часто используют систему lacZ с геном р-галактозидазы в качестве репортера. Само собой разумеется, что на всех этапах проведения отбора необходимо ставить контрольные пробы, так как весь опыт экспериментальной работы показывает, что лучше поставить десять лишних контролей, чем не поставить одного нужного. Ведь в случае ошибки потери времени будут несопоставимы со временем, затраченным на постановку контрольных экспериментов.
