Научная литература
booksshare.net -> Добавить материал -> Биология -> Патрушев Л.И. -> "Искусственные генетические системы. Том 1" -> 150

Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.

Патрушев Л.И. Искусственные генетические системы. Том 1 — М.: Наука, 2004. — 256 c.
Скачать (прямая ссылка): iskusstvenniegeneticheskie2004.djvu
Предыдущая << 1 .. 144 145 146 147 148 149 < 150 > 151 152 153 154 155 156 .. 221 >> Следующая

Гораздо менее понятным феноменом являются ложноотрицательные результаты отбора в системе Y2H, которые проявляются в том, что взаимодействующие друг с другом белки не оказывают влияния на транскрипцию гена-репортера. Хотя такие артефакты не представляют серьезной проблемы в опытах по направленной эволюции белков, основной задачей которой является отбор белков, эволюционирующих к нужным свойствам, к такой возможности необходимо относиться очень серьезно при использовании разных систем Y2H в крупномасштабных исследованиях. Например, попытки воспроизвести результаты работы по изучению интер-
актома дрожжей (совокупности всех белок-белковых взаимодействий клетки), полученные с помощью одной из таких систем, в другой системе позволили выявить только -25% обнаруженных ранее взаимодействий [135]. Подобные проблемы вероятно будут отступать параллельно с ростом понимания механизмов белок-белковых взаимодействий и активации транскрипции.
Бактериальные дигибридные системы (В2Н). Одним из преимуществ системы В2Н перед Y2H при осуществлении отбора во время направленной эволюции белков является более высокая эффективность трансформации бактериальных клеток, что позволяет исследовать одновременно до 108 белков, а это на два порядка превышает возможности дрожжевой системы. Высокая скорость деления бактериальных клеток сокращает время проведения экспериментов, кроме того клетки Е. coli являются эталоном в опытах по генной и белковой инженерии. В связи с этим системы В2Н становятся все более популярными в исследованиях белок-белковых взаимодействий.
В одной группе систем В2Н используют свойства бактериальных репрессоров и активаторов транскрипции, которые часто являются димерами со структурно различающимися доменами DBD и AD. На рис. 51 схематически изображены функциональные взаимодействия в трех В2Н-системах. В одной из первых разработанных систем С-концевой домен АД34-репрессора, обеспечивающий его димеризацию, что необходимо для проявления его активности, был заменен на функционально эквивалентный домен “лейциновая застежка” дрожжевого белка-активатора транскрипции GCN4 (рис. 51, а) [136]. Химерный белок оказался стабильным и хорошо выполнял функции белка-репрессора in vivo. Одновременно такая замена предотвращала образование гетеродимеров между А434- и А,-репрессорами, которые распознают разные последовательности операторов. Исследуемый белок X объединяли с С-концом модифицированного А434-репрессора, который взаимодействует с оператором Х434. Другой анализируемый белок Y соединяли с С-концом А,-репрессора, который сам по себе не может эффективно взаимодействовать с мутантным ^-оператором. Его взаимодействие происходит лишь в том случае, если белки X и Y образуют комплекс. При этом А,-репрессор подавляет транскрипцию гена-репортера lacZ, предотвращая взаимодействие РНК-полимеразы с промотором. Такая система обеспечивала лишь 10-кратное изменение уровня транскрипции гена-репортера на фоне продуктивного взаимодействия между исследуемыми белками и, следовательно, была мало пригодна для изучения слабых белок-белковых взаимодействий.
Рис. 51. Варианты бактериальных дигибридных систем В2Н [115]
а - система, основанная на природных бактериальных белках-репрессорах. С-концевая часть репрессора Фага X 434 соединена через домен “лещиновая застежка” (L), обеспечивающий димеризацию молекул, с исследуемым белком X. Взаимодействие таких гибридных молекул с оператором X 434 не влияет на транскрипцию гена-репортера, однако если белки X и Y образуют комплекс, домены ^-репрессора приобретают способность связываться с гомологичным низкоаффинным оператором, конкурируя с РНК-полимеразой за промотор ге-на-репортера;
б - подавление транскрипции изгибанием ДНК. Гибридный белок АгаС-Х активирует ген-репортер araBAD\ взаимодействие АгаС-Х с гибридным белком LexA-Y (L-Y) сопровождается связыванием LexA (L) оператором и подавлением транскрипции;
в - ?1-Репрессор, объединенный с белком X, может активировать РНК-по-лимеразу, если белок X взаимодействует с белком Y, объединенным в одной полипептидной цепи с N-концевым доменом а-субъединицы РНК-полиме-разы
Дальнейшее 10-кратное повышение чувствительности было достигнуто в системах второго типа при использовании белков AraC-LexA (рис. 51, б) [137]. В этом случае три тандемных копии оператора LexA вводят перед сайтом инициации транскрипции гена lacZ, который находится под контролем промотора гена araBAD. Белок АгаС, как сам по себе, так и в виде гибрида с исследуемым белком, активирует транскрипцию гена lacZ. Если ги-
бридные белки X-LexA и У-АгаС взаимодействуют друг с другом, то происходит изгибание ДНК в области промотора, что приводит к предотвращению транскрипции гена-репортера по неясному до конца механизму и может быть следствием инактивации РНК-полимеразы в этой области или предотвращения ее взаимодействия с промотором.
В системе третьего типа последовательность ^-оператора помещают перед промотором гена-репортера таким образом, что он сам по себе не влияет на транскрипцию даже в присутствии соответствующего репрессора (рис. 51, в) [138]. В этой системе используют гибридный белок Х-А,-репрессор, а также гибридную, измененную в N-концевой части а-субъединицу РНК-полимера-зы Y-а, входящую в состав холофермента. Такая модифицированная РНК-полимераза самостоятельно не может эффективно взаимодействовать с промотором, однако, если между исследуемыми белками X и У имеет место продуктивное взаимодействие, фермент стабилизируется на промоторе, и происходит активация транскрипции гена-репортера lacZ. В этой системе взаимодействие гибридных белков Gal4 и Gall 1 между собой с KD = 10~7 М активирует транскрипцию гена в 45 раз. На подобном принципе была разработана В2Н-система с геном-репортером HI S3, позволяющим проводить контр-селекцию в присутствии 5-FOA [139], а кроме того и система Y2H [140]. Так же, как и в случае У2Н-сис-тем, у систем В2Н имеются варианты, основанные не на модуляции транскрипции, а на восстановлении ферментативной активности при сближении двух белковых фрагментов, например, активности аденилатциклазы [141].
Предыдущая << 1 .. 144 145 146 147 148 149 < 150 > 151 152 153 154 155 156 .. 221 >> Следующая
Реклама

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed

Есть, чем поделиться? Отправьте
материал
нам
Авторские права © 2009 BooksShare.
Все права защищены.
Rambler's Top100

c1c0fc952cf0704ad12d6af2ad3bf47e03017fed