Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Рибосомный дисплей. В системах с использованием рибосом-ного дисплея цикл направленной эволюции белков выглядит следующим образом (рис. 48, а) [112-114]. Двухцепочечную ДНК исходной клонотеки нуклеотидных последовательностей, кодирующих различные мутантные формы исследуемого белка, транскрибируют in vitro, например, с помощью очищенной TV-РНК-полимеразы. Образовавшуюся мРНК, которая на 3-конце не содержит терминирующего кодона, транслируют в бесклеточной белоксинтезирующей системе из ретикулоцитов кроликов. После того, как работающие рибосомы достигают 3-концов транслируемых мРНК, синтез белка прекращается без распада тройных комплексов мРНК-рибосома-синтезированный белок. Комплексы дополнительно стабилизируют добавлением в реакционную смесь ионов Mg2+ и фракционируют на основании свойств синтезированных полипептидов, например, с помощью аффинной хроматографии. После чего очищенную мРНК используют в качестве матрицы для обратной транскрипции с целью получения двухцепочечной кДНК, которую, в свою очередь, амплифи-цируют с помощью ПЦР. Поскольку один из праймеров содер-
Рибосомный дисплей
Транскрипция in vitro
мРНК-дисплей
Транскрипция in vitro
мРНК
мРНК
Трансляция in vitro
ДНК
Лигирование с линкером
3' Нативный белок, связанный с рибосомой
| Аффинная хроматография
ел ^
ПЦР
Мутагенез с помощью ПЦР
ттт
| Элюирование мРНК
J'
3’
Обратная транскрипция
5’ Гибридная з,
мРНК (Р)
ПЦР
Мутагенез с помощью ПЦР
Трансляция in vitro
Пептидил- . трансферная I
Очистка конъюгата мРНК с белком
Обратная транскрипция
Аффинная хроматография
Элюирование кДНК из комплекса
О
о° О
Рис. 48. Рибосомный дисплей и мРНК-дисплей [115]
а - в рибосомном дисплее связь между генотипом и отбираемым фенотипом (между мРНК и кодируемым полипептидом) осуществляется нековалентно непосредственно через рибосомные частицы;
б- в мРНК-дисплее мРНК и кодируемый полипептид связаны ковалентно через молекулу пуромицина (Р), что значительно повышает эффективность системы
жит последовательность промотора Т7-РНК-полимеразы, продукт амплификации может быть снова транскрибирован in vitro, а полученная мРНК задействована в новом цикле отбора по рассмотренной выше схеме.
мРНК-дисплей (дисплей на основе РНК-белковых конъюгатов). В 1997 г. Р. Робертсу и Дж. Шостаку удалось существенно повысить эффективность рибосомного дисплея с помощью одной замечательной модификации исходного метода [114—116]. В их системе окончание трансляции мРНК in vitro сопровождалось образованием ковалентной связи между С-концевым аминокислотным остатком синтезированного полипептида и 3'-концом мРНК, в результате трансляции которой этот полипептид образовался. Связь между мРНК и пептидом оказывалась более прочной, чем в предыдущем случае, что облегчало их совместную очистку и использование в направленной эволюции белковых молекул по схеме, основные этапы которой совпадают с уже рассмотренными выше. При таком подходе к 3'-концам молекул мРНК, синтезированным in vitro на первом этапе (рис. 48, б), присоединяли короткий (19-30 нт) олигодезоксирибонуклеотидный линкер, ковалентно связанный своим 3'-концом с молекулой пу-ромицина. Стандартный 30-звенный линкер - это 5'-(dA)27dCdCP, где Р - остаток пуромицина. Молекула пуромицина, классического ингибитора биосинтеза белка, по своей структуре имитирует аминоацилированную тРНК и после попадания в A-участок рибосомы присоединяется рибосомой к НООС-группе С-концевого аминокислотного остатка растущей цепи полипептида амидной связью. Это сопровождается прекращением трансляции и освобождением недостроенной полипептидной цепи. Наличие в линкере олиго^А)-последовательности позволяет производить полное отделение свободной мРНК, оставшейся после завершения трансляции, на олиго^Т)-колонках от конъюгатов для исключения участия данных молекул в последующих раундах отбора.
Модифицированные мРНК нормально транслируются рибосомами до тех пор, пока рибосомы не достигают границы РНК-ДНК, где трансляция заканчивается распознаванием предпоследнего 3'-концевого кодона мРНК перед последовательностью ДНК-линкера [114]. Остаток пуромицина, который находится на 3'-конце линкера, попадает в A-участок рибосомы и присоединяется к С-концевому аминокислотному остатку растущего полипептида по вышеописанной схеме. Это сопровождается образованием конъюгата синтезированного белка с кодирующей его мРНК и освобождением конъюгата в реакционную смесь. Фенотипический признак в виде структурных и функциональных осо-
бенностей синтезированного белка оказывается связанным с генотипом (информацией, заключенной в первичной структуре) кодирующей его мРНК, поскольку в такой системе конъюгат мРНК с пуромицином выполняет двойную функцию: матрицы и акцептора строящегося полипептида. После выделения конъюгатов их можно использовать в последовательных циклах обогащения по исследуемому свойству полипептида, амплификации матрицы в виде кДНК, ее транскрипции и трансляции в бесклеточной системе. При этом этап отбора полипептида может быть проведен как до синтеза первой цепи ДНК обратной транскрип-тазой, так и после осуществления ее синтеза.
