Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Сегодня В2Н-системы еще находятся в начальной стадии своего развития. Несмотря на ряд отмеченных выше преимуществ таких систем, они обладают и существенными недостатками. В частности, в бактериальных клетках труднее, чем у дрожжей, добиться сосуществования нескольких плазмид. Кроме того, процесс интеграции генов в хромосому бактерий менее эффективен, чем у дрожжей. Тем не менее, поскольку интерес к системам В2Н сохраняется, преодоление технических затруднений является вопросом времени.
Моногибридные (Y1H) и тригибридные (Y3H) дрожжевые системы. Моногибридная система (one hybrid system), основанная на той же концепции, что и Y2H, является ее упрощенным вариантом. Как следует из названия, основным действующим началом моногибридной системы является один гибридный белок, в котором AD-домен соединен с гетерологичным DBD-доменом (см. рис. 49, б). Система позволяет осуществлять поиск белков,
взаимодействующих со специфическими последовательностями ДНК. В том случае, если исследуемый полипептид обладает искомой DBD-активностью, AD-домен активирует транскрипцию гена-репортера. Альтернативно с помощью системы Y1H можно проводить in vivo поиск последовательности нуклеотидов, с которой взаимодействует конкретный DBD в клонотеке таких последовательностей, созданной на индивидуальных плазмидах. Оба этих подхода плодотворно используются в современных исследованиях, в том числе для идентификации новых факторов транскрипции (см. например [142-144]).
Тригибридная дрожжевая система (Y3H) является дальнейшим развитием системы Y2H [118,142]. Этот вариант чаще всего используется с целью исследования РНК-белковых взаимодействий. Для активации (или в другой модификации ингибирования) транскрипции гена-репортера в ней задействованы три гибридных макромолекулы: два гибридных белка, один из которых содержит DBD-домен, соединенный с универсальным РНК-связы-вающим доменом (в данном примере с белком оболочки фага MS2), и AD-домен, объединенный с белком Y, взаимодействие которого с конкретной последовательностью РНК анализируется (рис. 49, в). Третьим компонентом является гибридная РНК, содержащая универсальную якорную последовательность, взаимодействующую с белком MS2, и последовательность X, способность которой взаимодействовать с белком Y исследуется. В том случае, когда имеет место РНК-белковое взаимодействие, формируется тройной комплекс, активирующий промотор гена-ре-портера. В другом варианте система Y3H может быть использована для изучения взаимодействий белков-рецепторов с низкомолекулярными лигандами, получившими название химических индукторов димеризации (chemical inducers of dimerization - CID) (рис. 49, г). В этом случае в качестве третьего компонента системы используют двойной лиганд L1-L2, у которого часть L1 взаимодействует с белком X, а взаимодействие L2 с белком Y исследуется. (Возможен и обратный вариант, когда изучается взаимодействие L1 с белком X.) При наличии взаимодействия происходит активация (или в других конструкциях подавление) активности гена-репортера.
Достижения белковой инженерии
У белковой инженерии большое будущее. Но даже достижения сегодняшнего дня в данной области весьма значительны. Мы являемся свидетелями активного использования белков и ферментов для крупномасштабного тонкого химического синтеза, эффективного разделения рацемических смесей энантио-меров, в качестве биосенсоров, лекарственных средств при заместительной терапии многих заболеваний человека, для получения пищевых продуктов, детергентов и эффективных моющих средств. Все это требует проведения поиска еще более эффективных биокатализаторов, в том числе и создания искусственных измененных ферментов методами белковой инженерии. Наш краткий обзор не ставит задачи дать исчерпывающую картину полученных результатов, и основной акцент делается на использовании генно-инженерных методов при конструировании белков с новыми свойствами. Однако было бы несправедливым умолчать о химических подходах получения биокатализаторов с новыми свойствами, активно применяемых в современной биотехнологии.
3.1. Химические модификации белков
Использование химических методов для направленного изменения свойств ферментов, по-видимому, началось в 1966 г. с работ JI. Полгара и М. Бендера [145], а также К. Ниита и Д. Кош-ланда [146], которые применили своеобразный “химический мутагенез” на уровне белковой молекулы для превращения остатка Ser в Cys в каталитической триаде активного центра субтилизи-на. Интерес к этому направлению исследований был стимулирован во второй половине 1980-х гг. опытами Е. Кайзера, в частности, присоединившего флавиновый кофермент к папаину, что привело к превращению протеиназы в оксидоредуктазу [147]. Сегодня ковалентные и нековалентные химические модификации белковых молекул являются широко распространенным подходом к изменению их свойств [148]. Ниже будут кратко рассмотрены три современных подхода к улучшению свойств ферментов разными химическими методами.
3.1.1. Искусственные поперечные сшивки в белках
Введение молекулярных поперечных сшивок в белки широко применяется в настоящее время для их стабилизации. Для этих целей создают внутримолекулярные и межмолекулярные поперечные сшивки с использованием различных бифункциональных и полифункциональных реагентов. В частности, хорошие результаты были получены на основе глутарового альдегида, который вначале был применен для стабилизации кристаллов карбокси-пептидазы с целью их дальнейшего исследования с помощью рентгеноструктурного анализа.
