Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Промотор, под контролем которого происходит транскрипция гена-репортера, обеспечивает второй уровень контроля чувствительности системы отбора. Как правило, промотор обеспечивает некий базальный уровень транскрипции независимо от наличия белка-активатора. При этом, чем ниже такой уровень, тем сильнее ген-репортер реагирует на действие белка-активато-
ра, и тем чувствительнее система отбора. Для понижения базального уровня транскрипции в ряде случаев приходится вводить в конструкцию перед промотором цмс-действующую репрессирующую последовательность URS (upstream repressing sequence) [127].
Наконец, третий уровень чувствительности системы отбора обеспечивает ген-репортер как таковой. В рассматриваемой системе Y2H применяют гены, обеспечивающие калориметрические способы обнаружения их активности, а также способность роста клеток в определенных условиях культивирования. Ген lacZ, использованный в системе Y2H первого поколения в качестве репортера, кодирует (3-галактозидазу Е. coli. Этот фермент обладает широкой субстратной специфичностью и может расщеплять ряд хромогенных субстратов, включая 5-бром-4-хлор-3-индолил-(3-0-галактопиранозид (X-gal) и о-нитрофенил-p-D-ra-лактопиранозид (ONPG), продукты расщепления которых могут быть обнаружены как на твердой питательной среде (по цвету колоний), так и в жидких средах. Кроме того, широкое распространение получили гены MEL1 и gus А, кодирующие, соответственно, а-галактозидазу и (3-глюкуронидазу, активность которых обнаруживают с использованием хромогенных субстратов 5-бром-4-хлор-3-индолил-а-0-галактопиранозида (X-a-D-gal) и 5-бром-4-хлор-3-индолил-(3-0-глюкуроновой кислоты (X-gluc) [124]. Применение в качестве репортера зеленого флуоресцирующего белка (green fluorescent protein - GFP) или его производных делают систему детекции еще более простой и эффективной, так как в этом случае для обнаружения экспрессии его гена не требуется никаких дополнительных условий, кроме наличия биосинтеза самого белка и, конечно, соответствующего оборудования. (О флуоресцирующих белках подробнее см. ниже раздел 3.2.2.)
Введение в число генов-репортеров ауксотрофных маркеров значительно повысило эффективность отбора взаимодействующих макромолекул в системе Y2H, так как позволило одновременно следить за взаимодействием до 106 разных белков. Для этой цели в дрожжевых системах наиболее часто используют гены HIS3, LEU2, ADE2 и URA3, кодирующие жизненно важные ферменты биосинтеза аминокислот или нуклеотидов. Это обеспечивает клеткам способность роста без соответствующего добавления аминокислот или нуклеотидов в питательные среды. В частности, для гена HIS3 характерен высокий базальный уровень активности, которая может регулироваться 3-амино-1,2,4-триа-золом (3-АТ), конкурентным ингибитором белкового продукта этого гена. Эффективность отбора с использованием генов LEU2 и ADE2 контролируется изменением концентраций, соответст-
1
Пептидное ингибирование димер изации белков
I Сайт, связьшающий DBD | URA3 ген-репортер |
,____________._______________, X
| Сайт, связьшающий DBD | | URA3 ген-репортер]
Ж
(™)
Белковое ингибирование диме-
| Сайт, связывающий DBD| I | ризации
/--- белков
<sf, ?
| Сайт, связывающий TetR| | HIS3 ген-репортер
Z> Y
Ж
tet
Л
| Сайт, связьшающий TetR _______HIS3 ген-репортер |
в
| Сайт, связывающий DBD| URA3 ген-репортер___________ |Сайт, связывающий DBD
URA3 ген-репортер
Рис. 50. Варианты дигибридной дрожжевой системы, разработанные для отбора ингибиторов белок-белковых взаимодействий (а, б) или белков, взаимодействующих между собой (в) [118]
а - обратная система Y2H. Взаимодействие белков X и Y активирует ген-репортер URA3, что при наличии 5-фтороротовой кислоты (5-FOA) в питательной среде приводит к гибели клеток; подавление взаимодействия исследуемым белком делает клетки жизнеспособными в этих условиях;
б - разделенная гибридная система. Взаимодействие между белками X и Y активирует ген tet, кодирующий репрессор TetR, который, в свою очередь, подавляет транскрипцию гена-репортера HIS3, необходимую для роста клеток на среде без гистидина; нарушение взаимодействия X и Y активирует ген HIS3, что делает клетки жизнеспособными;
в - система с репрессируемым трансактиватором. Активирующий белок X (АХ) обладает способностью активировать ген URA3, что в присутствии 5-FOA приводит к летальным последствиям для клетки; его взаимодействие через исследуемый домен X с доменом Y гибридного белка репрессора, объединенного в одной молекуле с репрессирующим доменом (RD), подавляет транскрипцию гена URA3
венно, Leu и аденина в питательной среде. Ген URA3, как уже упоминалось выше, обеспечивает позитивный и негативный отбор. Кроме того, для негативного отбора применяют ген CYH2, поскольку его экспрессия делает клетки дрожжей чувствительными к циклогексимиду, ингибитору элонгации полипептидных цепей у эукариот [127].
