Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
2.3.4. N-гибридные системы в исследовании белков
Специфические белок-белковые и белково-нуклеиновые взаимодействия лежат в основе функционирования всех без исключения генетических систем. Не менее важную роль в данных процессах играют и взаимодействия между белками и низкомолекулярными соединениями. Поэтому исследование механизмов таких взаимодействий, а также идентификация молекулярных партнеров, участвующих в формировании функционирующих макромолекулярных комплексов, является важнейшей задачей молекулярной биологии. Грандиозность задачи привлекла в эту область большое количество исследователей и породила обилие разработок, направленных на ее решение. Одним из методических прорывов последнего времени в изучении белок-белковых взаимодействий было создание дрожжевой ди-гибридной системы, которая с тех пор широко используется для решения многих аналогичных проблем, в том числе и для отбора рекомбинантных белков, полученных методами белковой инженерии [117, 118].
Дрожжевая дигибридная система оценки белок-белковых взаимодействий (Y2H). Система Y2H (yeast two-hybrid assay) была разработана С. Филдсом и О. Сонгом в 1989 г. для исследования белок-белковых взаимодействий в клетках дрожжей [119]. В последующие годы система получила широкое распространение и претерпела множество изменений и усовершенствований благодаря трем несомненным достоинствам, изначально присутствующим в этом подходе. Во-первых, метод позволяет прямо и непосредственно обнаруживать взаимодействие между двумя белками в живой клетке. Во-вторых, функционирование системы не требует предварительных знаний о природе пары белков, которые в ней исследуются, следовательно, система может быть использо-
вана для изучения взаимодействий между любыми, в том числе и ранее неизвестными белками. Наконец, данные об аминокислотных последовательностях анализируемых белков можно легко извлечь из нуклеотидных последовательностей рекомбинантных плазмид, которые их кодируют, что существенно облегчает идентификацию белковых молекул.
Принцип действия системы Y2H основан на наблюдении, что для восстановления активности эукариотических активаторов транскрипции, два домена которых - активирующий (activation domain, AD) и ДНК-связывающий (DNA binding domain, DBD) -физически разделены путем разрыва полипептидной цепи, не требуется восстановления разрыва. Активность белков в ряде случаев можно восстановить просто смешивая домены друг с другом в растворе, в том числе и в комбинации с доменами других активаторов транскрипции [120,121].
Система Y2H включает в себя два гибридных белка: “приманку” (bait) - X-AD и “хищника” (prey) - Y-DBD, каждый из них, в свою очередь, построен из двух половин: белков X или Y, взаимодействие между которыми исследуется, а также одного из двух доменов: активатора транскрипции DBD или AD (рис. 49, а). Кроме того, интегральной частью системы Y2H является ген-репор-тер, находящийся под контролем промотора, активируемого фактором транскрипции с доменами AD и DBD. Если белки X и Y взаимодействуют между собой, то их димеризация будет сопровождаться сближением ассоциированных с ними доменов, что приведет к образованию гетеродимера с активностью исходного фактора транскрипции и активацией гена-репортера, экспрессию которого легко обнаружить фенотипически, например, по ферментативной активности кодируемого этим геном белка. Плаз-миду-“приманку” и плазмиду-“хищника” вводят в гаплоидные клетки дрожжей, относящиеся к разным типам спаривания, а и а, скрещивание между которыми приводит к образованию диплоидных штаммов, содержащих обе плазмиды.
Первоначально работоспособность системы Y2H была продемонстрирована с использованием двух дрожжевых белков, физически взаимодействующих друг с другом in vivo. Были сконструированы две плазмиды, каждая из которых кодировала гибридный белок, в одном случае, серин-треониновую протеинкиназу SNF1, объединенную в одной полипептидной цепи с DBD-доме-ном фактора транскрипции Gal4, а в другом - белок-активатор протеинкиназы SNF4 с AD-доменом того же фактора. Последовательность нуклеотидов, с которой специфически взаимодействует Gal4, поместили перед геном (3-галактозидазы, а сам реком-
Рис. 49. Варианты «-гибридных дрожжевых систем, разработанные для исследования взаимодействия белков друг с другом и различными лигандами [118]
а) дигибридная система Y2H, б) моногибридная система Y1H; в и г - варианты тригибридной системы Y3H. AD - активирующий домен фактора транскрипции; DBD - ДНК-связывающий домен; X и Y - белки, между которыми исследуется взаимодействие; MS2 - белок оболочки фага MS2. В системе (в), разработанной для исследования взаимодействий белков с РНК, изучают гибридную РНК, у которой последовательность R всегда взаимодействует с белком MS2, а под вопросом взаимодействие последовательности X с белком Y. В системе (г) использованы два лиганда, соединенных линкером; молекула слева является специфическим лигандом для белка X, а исследуется взаимодействие молекулы, расположенной справа, с белком Y
