Искусственные генетические системы. Том 1 - Патрушев Л.И.
Скачать (прямая ссылка):
Принцип действия клеточного дисплея заключается в экспрессии на поверхности клеток гетерологичных белков (белков-пассажиров), которые отсутствуют у данного организма, объединенных в составе гибридной молекулы с помощью пептидного спейсера с полипептидной цепью белка-носителя, обеспечивающего заякоривание всей конструкции в мембране клеток. При этом используют гибридные белки трех типов, в которых белок-пассажир находится на N-конце, С-конце или во внутренней части белка-носителя в виде сэндвича. Для успешного выполнения своих функций белки-носители должны отвечать, по крайней мере, четырем требованиям: 1) обладать эффективной сигнальной или транспортной последовательностью, обеспечивающей прохождение гибридного белка через внутренние мембраны клеток; 2) проявлять сильные якорные свойства для прочного удерживания белка-пассажира на поверхности клеток; 3) должны быть совместимыми с белками-пассажирами, т.е. не дестабилизироваться после объединения с ними; 4) демонстрировать устойчивость к протеолитическим ферментам, присутствующим в пери-плазматическом пространстве или культуральной жидкости. В качестве векторов для генов гибридных белков используют экспрессирующие плазмиды или хромосомы вирусов.
Природа белка-пассажира также имеет большое значение для эффективности функционирования клеточного дисплея и во многих случаях является определяющей. Эти белки оказывают сильное влияние на транслокацию (перенос) гибридных белков через мембрану, их фолдинг и стабильность.
Функциональность клеточного дисплея в большой степени зависит и от самих клеток-хозяев. Так, грамотрицательные бактерии из-за хрупкости внешней мембраны сильно затрудняют получение клеточного дисплея. Тем не менее, клетки Е. coli используются для этих целей благодаря наличию хорошо разработанного молекулярно-генетического инструментария, в том числе эффективных методик трансформации, а также охарактеризованных мутантов, которые облегчают применение Е. coli. Грамполо-жительные бактерии, особенно В. subtilis и бактерии рода
Staphylococcus, особенно пригодны для создания биокатализаторов и адсорбентов, так как обладают мембранами, достаточно устойчивыми к внешним воздействиям. Однако эти бактерии избегают использовать для скрининга клонотек белков и пептидов. Для этой цели обычно берут клетки дрожжей S. cerevisiae, поскольку в них системы фолдинга и секреции белков близки таковым клеток животных, они считаются безопасными для человека, условия их культивирования хорошо изучены и, кроме того, заякоривание гибридных белков на мембранах в данном случае можно осуществлять с помощью остатка гликозилфосфатидили-нозитола и дисульфидных связей. Основываясь на этих принципах, клетки дрожжей используют для создания оральных вакцин и других биотехнологических целей.
В целом, метод отбора эволюционирующих белков с помощью клеточного дисплея удобен, прежде всего, своей прозрачностью, так как позволяет непосредственно in situ следить за кинетическими параметрами отбираемых макромолекул [111], что, как правило, невозможно осуществить с помощью дисплеев, основанных на использовании субмикроскопических частиц - бактериофагов и рибосом. В этой связи данная область исследований в настоящее время активно развивается.
2.3.3. Рибосомный дисплей и мРНК-дисплей
Одним из основных параметров, обеспечивающих успех использования комбинаторных клонотек нуклеотидных последовательностей в отборе тех из них, которые кодируют белки или пептиды с требуемыми свойствами, является представительность набора последовательностей в клонотеке. Трудно поймать черную кошку в темной комнате, особенно, если ее там нет. Найти последовательность в клонотеке даже самыми изощренными методами можно лишь в том случае, если она в ней присутствует. Репрезентативность клонотек, основанных на использовании бактериальных, дрожжевых клеток или вирусов, зависит от эффективности трансформации или трансфекции клеток, верхний предел которых ограничен 10ю и 107 последовательностями для бактерий и дрожжей соответственно. Преодолеть ограничение можно путем отказа от попыток введения рекомбинантных молекул ДНК внутрь клеток и перехода к работе непосредственно с рекомбинантными последовательностями нуклеотидов в бесклеточных системах, что позволяет создавать клонотеки, содержащие 1012- 1015 разных последовательностей и эффективно работать с ними. В этом случае верхний предел размера и молеку-
лярного разнообразия клонотеки определяет количество молекул матричной ДНК, которую можно амплифицировать in vitro (обычно 5-50 нмолей) в разумных объемах реакционных смесей для проведения ПЦР (0,1—1,0 л).
В настоящее время разработано два типа систем отбора нуклеотидных последовательностей комбинаторных клонотек, которые основаны на их транскрипции, с последующей трансляцией образовавшихся мРНК в бесклеточной системе. В одной из систем отбора первого поколения транскрибируемые последовательности были сконструированы таким образом, что у кодируемых ими мРНК отсутствовали кодоны терминации трансляции. После завершения трансляции мРНК тройной комплекс мРНК-рибосома-растущая полипептидная цепь не распадается, и каждый синтезированный таким образом полипептид остается в контакте с кодирующей его последовательностью нуклеотидов. Фенотип оказывается прямо связанным с породившим его генотипом. Поэтому нужные последовательности нуклеотидов можно обнаруживать и выделять на основании свойств взаимодействующих с ними полипептидов, например, их хроматографических параметров. Задача еще более упрощается при использовании бесклеточных систем второго поколения, в которых связь между РНК и кодируемым ею полипептидом становится ковалентной, а следовательно, повышается надежность связи между генотипом и фенотипом эволюционирующих in vitro макромолекул.
